脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型建立

馮 旭，郭 蕊，梁臣艷，吳 玲，李 盼

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

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脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型建立

馮 旭，郭 蕊，梁臣艷*，吳 玲，李 盼

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001)

目的：建立脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型。方法：隨機(jī)將60只昆明種小鼠分為5組，分別向小鼠尾靜脈注射生理鹽水和不同劑量的脂多糖，12h后檢查并評估各組小鼠的急性肺損傷情況，以確定合適的建模脂多糖劑量。確定合適的脂多糖劑量后，采用ELISA法分別于2、6、12h末摘取小鼠眼球取血并分離血清，測定血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平；采用HE染色觀察小鼠肺臟病理形態(tài)變化。結(jié)果：脂多糖劑量為4mg/kg時(shí)，小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α可持續(xù)保持較高水平。HE染色后，AIL組小鼠光鏡下可見以肺泡正常結(jié)構(gòu)消失、肺泡間隔明顯增厚、肺泡腔內(nèi)出血、大量炎性細(xì)胞浸潤為主要表現(xiàn)的組織病理變化，肺損傷6h最為明顯。結(jié)論：向小鼠尾靜脈注射脂多糖4mg/kg可成功復(fù)制AIL小鼠動(dòng)物模型。

脂多糖；急性肺損傷；動(dòng)物模型

急性肺損傷(ALI)是指由心源性因素以外的各種肺內(nèi)外致病因素導(dǎo)致的急性、進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，以肺部容積減少、肺順應(yīng)性降低、通氣/血流比例失調(diào)為病理特征，肺部影像學(xué)表現(xiàn)為非均一性滲出性病變，主要臨床癥狀為進(jìn)行性低氧血癥和呼吸窘迫[1]。ALI發(fā)展至嚴(yán)重階段被稱為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。近年來，ALI/ARDS的發(fā)病率逐年升高，且死亡率高達(dá)30%～40%[2]。內(nèi)毒素是G-細(xì)菌細(xì)胞壁的重要成分，又名脂多糖。當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或被人工破壞時(shí)，其可被釋放到細(xì)胞外，對宿主產(chǎn)生毒性效應(yīng)[3]。大量炎癥細(xì)胞參與了機(jī)體炎癥反應(yīng)，其中中性粒細(xì)胞(PMN)是導(dǎo)致細(xì)胞損害和肺組織損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞，也是造成過度性、失控性炎癥反應(yīng)的主要因素。炎癥介質(zhì)是參與和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的化學(xué)因子，其中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)等是重要的細(xì)胞炎癥介質(zhì)，是研究表征炎癥是否存在以及嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，已成為臨床測試是否有炎癥存在及其嚴(yán)重程度的通用指標(biāo)[4-6]。

1 材料與試劑

1.1 動(dòng)物

健康昆明小鼠，體重(18.0±2.0)g，雄性，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 (合格證號：SCXK桂2009-0002)。

1.2 試劑

大腸桿菌脂多糖(批號：1010A032，美國Sigma公司)；無菌生理鹽水(批號：A12061505，廣西裕源藥業(yè)有限公司)；多聚甲醛(批號：20100626，天津市博迪化工有限公司)；小鼠hs-CRP ELISA試劑盒(批號：201010，美國 R&D 公司)；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(批號：201010，美國R&D公司)； 小鼠IL-1βELISA 試劑盒(批號：201010，美國 R&D 公司)。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號：HHBII，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號：101-1-BS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)；高壓自動(dòng)滅菌器(型號：MLS-3750，日本三洋公司)；低溫高速離心機(jī)(型號：ST16R，美國熱電公司)；冰箱(型號：BCD-192DC，青島海爾公司)；全波長酶標(biāo)儀(型號：Epoch，美國伯騰儀器有限公司)。

2 方法

2.1 脂多糖溶液配制

將適量LPS溶于生理鹽水中配制成500μg/mL的溶液，臨用現(xiàn)配，剩余溶液暫放 4℃ 冰箱內(nèi)儲存，儲存時(shí)間不超過24h。

2.2 4%多聚甲醛溶液配制

精確稱取40g多聚甲醛，加入pH7.4 PBS溶液800mL，磁力攪拌器攪拌加熱至60℃，滴加NaOH溶液，完全溶解后，冷卻定容至1L，4℃儲藏備用。

2.3 小鼠尾靜脈注射脂多糖劑量確定

2.3.1 動(dòng)物分組與處理 選擇健康昆明種小鼠50只，按照LPS劑量(1、2、3、4 及5mg/kg)分為5組，各組小鼠尾靜脈注射相應(yīng)劑量的脂多糖，另選擇10只小鼠作為對照組，采用等體積無菌生理鹽水以同樣方法尾靜脈注射。摘取小鼠眼球取血，室溫下血液自然凝固30min后，于4℃下3 000r·min-1離心20min，分離血清，分裝凍存于-20℃。采用ELISA法檢測血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。隨后摘取小鼠左肺上葉，以4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色后進(jìn)行病理組織鏡檢。

2.3.2 血清 hs-CRP、IL-1β、TNF-α檢測 分別采用hs-CRP、IL-1β、TNF-α的ELISA檢測試劑盒，按照說明書操作。

2.4 尾靜脈注射脂多糖誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的時(shí)間效應(yīng)

2.4.1 動(dòng)物分組與處理 取雄性小鼠40只，隨機(jī)分為空白對照組(空白組)，不同給藥時(shí)間組(2、6、12h)ALI組，每組10只。根據(jù)小鼠體重尾靜脈注射 LPS 4mg/kg，并于給藥2、6、12h后取樣，空白組小鼠尾靜脈注射等體積無菌生理鹽水，于2、6、12h后取樣。

2.4.2 動(dòng)物標(biāo)本采集 ALI各組小鼠注射LPS后，于 2、6、12h 末摘取小鼠眼球取血，室溫下血液自然凝固30min后，于4℃下 3 000r·min-1離心20min，血清分離后分裝，-20℃凍存。采用ELISA法檢測血清中hs-CRP、IL-1β、TNF-α含量。摘取小鼠左肺上葉，置于4%中性甲醛溶液中固定24h，常規(guī)脫水石蠟包埋，制作切片，厚度為5μm，伊紅染色(HE 染色)。

2.4.3 血清hs-CRP、L-1β、TNF-α檢測 操作同“2.3.2”。

2.5 觀察指標(biāo)

在實(shí)驗(yàn)期間，即從開始進(jìn)行尾靜脈注射至實(shí)驗(yàn)結(jié)束為止，觀察各組小鼠的一般狀態(tài)和大體標(biāo)本。

2.6 檢測方法

取處理好的動(dòng)物標(biāo)本，于光鏡下觀察病理組織的形態(tài)變化。肺損傷評價(jià)指標(biāo)為肺泡和間隙水腫程度、中性粒細(xì)胞浸潤程度以及出血程度。設(shè)置的評估標(biāo)準(zhǔn)[22]為(視野里)：無損傷=0；25%損傷=1；50%損傷=2；75%損傷=3；全都損傷=4。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般狀態(tài)和大體標(biāo)本觀察

對照組小鼠呼吸平穩(wěn)，進(jìn)食正常，對外界刺激反應(yīng)無異常，無死亡；肺葉外觀無異常，質(zhì)軟，彈性好，呈粉紅色。脂多糖各劑量組小鼠精神萎靡，活動(dòng)減少、食欲下降、呼吸急促，四肢、口唇發(fā)紺。脂多糖劑量達(dá)到4mg/kg后，小鼠肺臟可見明顯淤血點(diǎn)、出血點(diǎn)和水腫，尤以6h組最為明顯。

3.2 各劑量組小鼠血清L-1β、TNF-α及hs-CRP水平比較

尾靜脈注射LPS后，小鼠血清中炎癥細(xì)胞因子hs-CRP、IL-1β、TNF-α 水平均明顯升高，LPS1組、LPS2組、LPS3組小鼠血清hs-CRP、TNF-α水平與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；LPS4組、LPS5組小鼠血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

3.3 時(shí)間效應(yīng)的血清hs-CRP、IL-1β、TNF-α水平比較

尾靜脈注射 LPS 后，ALI 組小鼠血清炎性細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、hs-CRP水平均明顯增加且顯著高于空白組，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2h組vs空白組、6h組vs空白組、12h組vs空白組P均<0.01)。隨著時(shí)間的延長，小鼠血清 hs-CRP水平呈逐漸上升趨勢；血清TNF-α水平經(jīng)LPS處理2h后達(dá)到高峰，6h時(shí)有所降低；血清IL-1β水平2h時(shí)達(dá)到高峰，6h時(shí)IL-1β水平有所降低，但仍高于空白組。結(jié)果見表2與圖1。

3.4 水平劑量的肺組織病理學(xué)評分比較

染色HE結(jié)果顯示，空白組小鼠無明顯炎癥反應(yīng)。對照組小鼠尾靜脈注射LPS后， LPS3、LPS4、LPS5劑量均可引起小鼠肺組織充血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，與空白組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LPS3組小鼠肺臟HE染色鏡檢中僅見輕度炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥反應(yīng)輕微；LPS4組小鼠肺臟可見炎癥細(xì)胞輕到中度浸潤，伴有組織淤血水腫，水腫程度不等，炎癥反應(yīng)較明顯；LPS5組小鼠可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，并伴有淤血。LPS1組、LPS2組小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)與空白組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別劑量(mg/kg)hs-CRP(mg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)空白組-24.03±1.19228.04±22.5457.55±3.40LPS1124.55±1.27262.56±28.6370.31±3.94▲▲LPS2225.21±1.34248.10±31.0173.75±6.745▲▲LPS3325.36±1.08253.88±32.5369.87±6.00▲▲LPS4425.91±0.78▲▲268.99±33.85▲76.13±5.20▲▲LPS5527.25±2.07▲▲290.47±58.35▲▲83.11±13.29▲▲

組別hs-CRP(μg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)空白組4.07±0.49416.27±49.2739.42±9.39LPS2h5.34±0.92▲▲582.08±70.98▲▲76.18±7.45▲▲LPS6h5.89±0.81▲▲561.96±71.94▲▲65.75±10.88▲▲LPS12h6.29±0.97▲▲528.45±64.16▲▲58.59±10.15▲▲

圖1 各組小鼠血清hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平比較

表3 水平劑量的肺部炎癥組織病理學(xué)評分比較

3.5 時(shí)間效應(yīng)的肺組織病理學(xué)評分比較

染色HE結(jié)果顯示，空白組小鼠無明顯炎癥反應(yīng)。對照組小鼠肺組織在光鏡下發(fā)生病理學(xué)改變，可見肺泡間隔增寬，部分肺泡塌陷，內(nèi)浸潤有較多數(shù)量的中性粒細(xì)胞，明顯充血，中性粒細(xì)胞浸潤程度與出血程度均顯著高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，以6h最為顯著，12h次之，2h最弱。見表4。

組別給藥劑量(mg/kg)炎癥評分空白組-0.50±0.53LPS2h42.60±0.70▲▲LPS6h43.20±0.63▲▲LPS12h42.00±0.67▲▲

4 討論

本研究設(shè)置了不同劑量的LPS(1、2、3、4、5mg/kg) ，旨在確定復(fù)制小鼠ALI模型的最佳條件，通過測定血清中炎癥細(xì)胞因子的水平和病理變化，綜合評價(jià)ALI模型是否成功建立。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同劑量的脂多糖可引起不同程度的ALI：當(dāng)LPS≥4mg/kg時(shí)，小鼠出現(xiàn)明顯的呼吸困難、四肢、口唇發(fā)紺等癥狀，血清中TNF-α、IL-1β、hs-CRP水平均顯著升高，出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤與組織瘀血水腫等病理學(xué)變化。該變化與ALI病程發(fā)展過程相似，說明當(dāng)LPS≥4mg/kg時(shí)，可顯著引發(fā)小鼠釋放抗炎因子。當(dāng)LPS劑量為5mg/kg時(shí)，可導(dǎo)致小鼠死亡現(xiàn)象，因此4mg/kg LPS為建立小鼠急性肺損傷模型的安全劑量。

本實(shí)驗(yàn)采用小鼠制備急性肺損傷模型，尾靜脈注射LPS 4mg/kg后，對3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠血清促炎因子hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平以及肺損傷程度進(jìn)行檢測，初步探討肺損傷過程中炎性介質(zhì)的相互關(guān)系及其變化規(guī)律。病理結(jié)果顯示，空白組小鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化不明顯，小鼠在注射LPS 2h后出現(xiàn)肺損傷，損傷程度隨時(shí)間變化，6h時(shí)損傷最明顯，表現(xiàn)為肺泡間隔明顯增厚，部分肺泡塌陷，大量中性粒細(xì)胞浸潤，明顯充血；但至12h時(shí)，病理變化又趨向減輕。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS注射6h時(shí)小鼠出現(xiàn)明顯的肺組織結(jié)構(gòu)損傷，證實(shí)ALI模型復(fù)制成功。

綜上所述，從開始進(jìn)行尾靜脈注射至觀察終點(diǎn)為止，各組小鼠全部存活，表明4mg/kg劑量的 LPS 安全性較高，用于靜脈注射建模安全性良好，且病理學(xué)改變以6h時(shí)最為顯著。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Establishment of Animal Model of Acute Lung Injury in Mice Induced by Lipopolysacharide

Feng Xu,Guo Rui,Liang Chenyan*,Wu Ling,Li Pan

(Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530001,China)

Objective:To establish acute lung injury(ALI) model induced by liPopolysaccharide in mice. Methods:Kun-ming mice were injected respectively with isometric stroke-physiological saline solution and LPS, An evaluation on acute lung injury was been executed at the end of 12h to confirmed anappropriate LPS dose for establishing mice model. The mice were culled eye ball after injected proper dose of LPS for 2h, 6h, 12h. The levels of serum high-sensitivity C-reactive protein (hs-CRP), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. Regular HE staining was applied to evaluate the inflammatory reaction of lung tissue. Results:The level of mice serum IL-1β,TNF-α and hs-CRP were raised after injection of LPS 4mg/kg. By microscopy, the lung tissue strueture of mices in ALI group were damaged, a large mount of neutrophil recruitment and the thiekened interalveolar septum with signifieantly hyperemia in lung tissue of the LPS group. Such changes listed above appeared most severely at the time Point of 6h after the injection of LPS. The ALI pathological score of the mices of the LPS group was higher than that of NS group. Conclusion:The ALI mice model could be duplicated successfully infusing by injection of LPS 4mg/kg in caudal vein.

LPS; ALI; Animal Model

2015-03-27

國家自然科學(xué)基金(81060336)；廣西自然科學(xué)基金( 2011GXNSFF018006)；“八桂學(xué)者”工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)

馮旭(1976-)，男，廣西中醫(yī)藥大學(xué)副教授，研究方向?yàn)橹兴?、民族藥有效成分和質(zhì)量控制。

梁臣艷，女，廣西中醫(yī)藥大學(xué)副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幱行С煞趾唾|(zhì)量控制。

R363

A

1673-2197(2015)14-0005-03

10.11954/ytctyy.201514003