田七注射液對阿霉素大鼠腎纖維化防治作用研究

胡 溪，吳金玉

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430014)

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田七注射液對阿霉素大鼠腎纖維化防治作用研究

胡 溪，吳金玉

(武漢市中醫(yī)醫(yī)院,湖北 武漢 430014)

目的：探討田七注射液對阿霉素大鼠腎纖維化的防治作用。方法：運(yùn)用切除右側(cè)單腎并重復(fù)注射阿霉素(ADR)的方法建立腎纖維化大鼠模型，將120只大鼠均分為5組：空白組、假手術(shù)組、模型組、對照組、田七組。對照組小鼠予血栓通注射液(20mL/100g/d)腹腔注射給藥，田七組小鼠予以田七注射液(2g/kg/d)腹腔注射，正常組和模型組小鼠給予生理鹽水灌胃。12周后處死大鼠，觀察大鼠的一般情況及腎功能、腎組織等情況，行病理檢查及免疫組化測定其ILK、α-SMA的表達(dá)。結(jié)果：與空白組和假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎功能、腎小球小管間質(zhì)損傷程度明顯升高，ILK、α-SMA的表達(dá)明顯上調(diào)；與模型組比較，田七組、對照組小鼠腎功能、腎小球及小管損傷程度明顯減輕，ILK、α-SMA的表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論：田七注射液可減輕腎功能損害，減輕腎小球和腎小管的損傷，抑制ADR腎纖維化大鼠ILK及α-SMA的表達(dá)，延緩腎纖維化發(fā)展進(jìn)程，可能是田七注射液防治腎臟纖維化的作用機(jī)制。

田七注射液；腎纖維化；防治作用

腎纖維化發(fā)展至終末期主要表現(xiàn)為慢性腎衰竭，也是慢性腎臟病進(jìn)展至終末期腎病的共同病理特征。研究表明，腎纖維化與祖國醫(yī)學(xué)中“瘀血”的基本病理機(jī)制一致，活血化瘀藥在一定程度上對腎纖維化有防治作用，三七為常用的活血化瘀藥物之一。本課題組選用三七典型中藥制劑——田七注射液防治阿霉素致腎纖維化大鼠，觀察其對腎纖維化大鼠腎功能、腎組織病理改變的影響，為臨床提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD雄性大鼠120只，體重(180±20g)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證：SCXK(湘)2011-0003。在廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部飼養(yǎng)，普通喂食飲水，每籠5只。飼養(yǎng)1周后建立模型。

1.2 藥物

田七注射液由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)，規(guī)格：100mL，含生藥20g。血栓通注射液(主要成分為三七總皂苷，廣西梧州制藥(集團(tuán))股份有限公司，規(guī)格：5mL,175mg)。注射用阿霉素(注射用鹽酸多柔比星，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：10mg/瓶)。

1.3 動物分組、造模及給藥方法

將120只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、對照組、田七組5組，每組24只。用10%水合氯醛(350mg/kg)給予造模大鼠行腹膜下麻醉，將其俯臥固定、取毛、備皮、消毒后，在后背正中往右1cm處開長為1～1.5cm的切口，暴露右腎，剝離腎臟周圍包膜，用止血鉗夾住腎動脈及輸尿管后結(jié)扎，摘除右腎，止血，予青霉素0.1mL腹腔注射抗感染，分層縫合、消毒。術(shù)后連續(xù)3天，肌注青霉素(0.8萬U/kg)。術(shù)后第7天，拆線，同時尾靜脈注射阿霉素5mg/kg，術(shù)后第30天重復(fù)給予尾靜脈注射阿霉素3mg/kg。正常組及假手術(shù)組不造模，其余3組均造模。造模后模型組大鼠及假手術(shù)組予以生理鹽水腹腔注射(10mL/kg/d)；對照組及田七組造模后，分別予腹腔注射血栓通注射液及田七注射液。正常組不予處理。實(shí)驗(yàn)期間均予以普通喂食，自由飲水。

1.4 觀察及檢測指標(biāo)

一般情況：觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、反應(yīng)能力、體重、飲食情況等；采用全自動生化分析儀檢測大鼠腎功能：BUN，SCr；采用免疫組化檢測大鼠腎組織ILK、α-SMA蛋白的表達(dá)。

1.5 病理學(xué)檢查

術(shù)后87天處死大鼠，留取腎臟組織， 10%甲醛溶液固定、乙醇梯度脫水、透明、浸蠟、包埋后制成3μm的石蠟切片，并進(jìn)行HE染色和Masson染色。

1.6 腎臟病理檢測法

腎組織在高倍鏡下隨機(jī)選取經(jīng)過染色處理的各組病理切片中30個腎單位進(jìn)行觀察：①腎小球硬化指數(shù)(GSI)采用文獻(xiàn)中的記載方法[1]，根據(jù)切片中的每個腎小球硬化面積進(jìn)行分級，共分5個等級：0級，即基本正常；1級，硬化面積為1%～25%；2級，硬化面積為26%～50%；3級，硬化面積為51%～75%；4級，硬化面積達(dá)到76%～100%。計(jì)算腎小球的硬化指數(shù)，根據(jù)公式GSI(%)=[(1×N1+2×N2+3×N3+4×N4)/每片腎小球總數(shù)]×100%，把1級損害腎小球個數(shù)(即N1)、2級損害腎小球個數(shù)(即N2)以此類推分別代入公式。隨機(jī)抽取每張標(biāo)本切片在光鏡(10mm×40mm)下的10個視野進(jìn)行計(jì)算，取其平均值，作為該標(biāo)本的腎小球硬化指數(shù)。②腎小管損傷指數(shù)(TII)按Goumenos等[2]法進(jìn)行半定量分析判斷。在400倍光鏡下，每張切片隨機(jī)選10個不含腎小球的視野。腎小管間質(zhì)病變由蛋白管型和腎小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎細(xì)胞的浸潤、間質(zhì)纖維化的程度等3個參數(shù)來判斷，并按0～3分評價(jià)，即0：腎小管無病理變化；1：輕度受損，視野內(nèi)損傷小于25%；2：中度受損，視野內(nèi)損傷25%～50%；3：重度受損，視野內(nèi)損傷大于50%。腎小管(間質(zhì))損傷指數(shù)由每個腎臟所有視野的損傷等級加權(quán)平均計(jì)算而得。每個樣本腎小管間質(zhì)評分為0～9分。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

造模前各組大鼠均有活力，反應(yīng)靈敏，眼球、舌質(zhì)淡紅，毛發(fā)順滑有光澤，食欲佳，糞便正常。造模大鼠(模型組、對照組、田七組)活力明顯減退，反應(yīng)遲鈍，眼球暗紅，舌質(zhì)絳紫，尾部出現(xiàn)瘀斑，并有弓背、蜷曲的狀況；對照組及田七組大鼠的進(jìn)食量、活動度、靈敏度略優(yōu)于模型組(P<0.05)，眼球淡紅、舌質(zhì)絳紫、尾部瘀斑有所改善。

實(shí)驗(yàn)過程中由于感染、藥物副作用、腎臟出血等原因大鼠出現(xiàn)死亡，最終各組小鼠數(shù)目為：正常組及假手術(shù)組各24只，模型組22只，對照組及田七組各23只。

2.2 各組大鼠BUN、SCr指標(biāo)比較

與正常組比較，模型組大鼠BUN、SCr均明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，田七組和對照組大鼠BUN、SCr均低于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；田七組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。提示田七注射液與血栓通作用相似，均能改善大鼠的腎功能。見表1。

表1 各組大鼠BUN、SCr指標(biāo)比較 (±s)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P>0.05。

2.3 各組大鼠腎組織病理學(xué)指標(biāo)比較

正常組和假手術(shù)組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管、腎小球無病理改變。腎小管間質(zhì)未見異常改變，亦無纖維化增生。

模型組小鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，腎小球系膜區(qū)呈彌漫性增寬，腎小球數(shù)量減少，硬化細(xì)胞數(shù)量明顯增多，腎小球基底膜明顯增厚，可見免疫復(fù)合物沉積。部分腎小球有新月體形成。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生壞死、崩解、脫落。腎小管管腔擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見蛋白管型。腎間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化明顯。

田七組和對照組小鼠腎小球系膜細(xì)胞輕度增生，腎小球系膜區(qū)輕度增寬。球囊粘連較模型組輕，腎小球發(fā)生硬化數(shù)量較模型組減少。腎小管輕度擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見少量蛋白管型和細(xì)胞脫落碎片，無明顯腎小管萎縮。腎間質(zhì)有少量炎癥細(xì)胞浸潤及輕度纖維化。

2.4 各組大鼠腎小球、腎間質(zhì)損傷指數(shù)的比較

結(jié)果顯示，田七組、對照組、模型組與正常組、假手術(shù)組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組相比較，田七組、對照組大鼠腎小球硬化指數(shù)及腎間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)均下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與田七組比較，對照組小鼠腎小球硬化指數(shù)及腎間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)均有所升高，但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明田七注射液和血栓通在一定程度上均可減輕大鼠腎組織病理損害。見表2。

表2 各組大鼠腎小球硬化指數(shù)、腎間質(zhì)損傷分?jǐn)?shù)比較 (±s，%)

注：與模型組比較，*P<0.01。

2.5 各組大鼠腎組織ILK、α-SMA蛋白表達(dá)比較

ILK、α-SMA免疫組化的檢測結(jié)果顯示：假手術(shù)組與正常組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與正常組比較，模型組、對照組、田七組小鼠ILK、α-SMA的表達(dá)范圍和程度明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對照組、田七組相比較，模型組小鼠ILK、α-SMA表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；對照組與田七組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各組大鼠腎組織ILK、α-SMA表達(dá)比較 (±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與對照組比較，△P>0.05。

3 討論

在腎纖維化中，間質(zhì)細(xì)胞核細(xì)胞間質(zhì)增多，特別是基質(zhì)蛋白合成增加，使大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)堆積[3]。腎纖維化與終末期腎病-慢性腎衰竭的進(jìn)展關(guān)系密切，因此對阻止或延緩腎纖維化臨床研究越來越多，腎間質(zhì)纖維化為本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)。大量研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在腎纖維化中起著關(guān)鍵作用[4]，其中以TGF-β1表達(dá)為主，ILK為TGF-β1/Smad信號通路的下游分子，誘導(dǎo)著EMT的生成，ILK會隨著腎臟損傷程度而加重，ILK的表達(dá)增加會破壞腎小管基底膜，促進(jìn)小管上皮細(xì)胞的遷移和入侵[5]，且α-SMA被認(rèn)為是肌成纖維母細(xì)胞(MFB)的標(biāo)志蛋白[6]，因此ILK及α-SMA在EMT和腎纖維化中起著關(guān)鍵作用，預(yù)防及干預(yù)腎纖維化進(jìn)程。

在祖國醫(yī)學(xué)中，腎纖維化與“腎絡(luò)癥積”原理一致[7]，病理基礎(chǔ)為瘀血阻絡(luò)。近年來對主要活血化瘀藥田七的研究不斷深入，特別是田七治療腎纖維化方向。在一系列的動物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)中，研究發(fā)現(xiàn)田七注射液可抗腎纖維化和改善腎功能。本實(shí)驗(yàn)中，田七注射液治療后SCr、BUN均有所降低，腎小球發(fā)生硬化數(shù)量及腎小管間質(zhì)病變較模型組減輕，ILK、α-SMA的表達(dá)明顯下調(diào)，證實(shí)田七注射液對腎纖維化具有預(yù)防和治療作用。

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(責(zé)任編輯：李嵐春)

2015-01-13

胡溪(1987-)，女，武漢市中醫(yī)醫(yī)院住院醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治腎臟病；吳金玉(1965-)，女，武漢市中醫(yī)醫(yī)院主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)、中西醫(yī)結(jié)合治療腎臟病。

R285.5

A

1673-2197(2015)10-0020-03

10.11954/ytctyy.201510009