腎病患者血漿代謝組學(xué)分析前樣品處理方法優(yōu)化

趙 靜，關(guān) 欣，包永睿，王 帥，孟憲生*，鄭紅光*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.中國(guó)人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

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腎病患者血漿代謝組學(xué)分析前樣品處理方法優(yōu)化

趙 靜1，關(guān) 欣2，包永睿1，王 帥1，孟憲生1*，鄭紅光2*

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 大連116600；2.中國(guó)人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院，遼寧 沈陽 110016)

目的：對(duì)代謝組學(xué)分析前慢性腎病患者血漿樣品的處理方法進(jìn)行優(yōu)化。方法：采用HPLC/TOF-MS技術(shù)分別對(duì)60例慢性腎病患者及30例健康志愿者的血漿處理方法進(jìn)行優(yōu)化研究。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)對(duì)慢性腎病患者及健康人血漿均可達(dá)到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分；用80%乙腈作為復(fù)溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分。結(jié)論：建立了采用HPLC/TOF-MS技術(shù)對(duì)代謝組學(xué)分析前樣品進(jìn)行處理優(yōu)化的方法，為研究慢性腎病患者血漿代謝組學(xué)奠定基礎(chǔ)。

慢性腎??；血漿；液質(zhì)聯(lián)用；樣品處理

慢性腎病是指由各種病因使腎單位發(fā)生進(jìn)行性破壞，不能充分排出代謝廢物和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致體內(nèi)出現(xiàn)代謝廢物潴留及水、電解質(zhì)與酸堿平衡紊亂，并伴有尿量和尿質(zhì)改變以及腎臟內(nèi)分泌功能障礙的疾病。代謝組學(xué)是通過比較對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組代謝物的不同，以尋找其代謝譜差異的一種研究方法。通過對(duì)由疾病誘導(dǎo)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行分析，可幫助了解病變過程和機(jī)體內(nèi)代謝途徑[1-2]，尋找新的疾病生物標(biāo)志物，同時(shí)輔助臨床診斷和治療。

在代謝組學(xué)研究過程中，樣品前處理環(huán)節(jié)是至關(guān)重要的，影響診斷結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。在樣品制備過程中，在保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)、可靠的基礎(chǔ)上，需要在樣品前處理時(shí)盡量除去其含有的蛋白質(zhì)并最大限度地保留全部樣品信息。本實(shí)驗(yàn)在液質(zhì)聯(lián)用的基礎(chǔ)上，建立慢性腎病血漿樣本處理?xiàng)l件的考察方法，并首次使用Agilent MPP12.1軟件的MFE功能進(jìn)行化合物提取，以化合物提取數(shù)量為考察指標(biāo)，為今后運(yùn)用代謝組學(xué)方法探討慢性腎病患者與健康人血漿代謝差異物，并根據(jù)代謝物的不同指導(dǎo)慢性腎病的臨床用藥奠定基礎(chǔ)。

1 研究對(duì)象

所選病例主要來源于沈陽軍區(qū)總醫(yī)院已獲知情同意的門診及住院患者，正常對(duì)照組為來自沈陽軍區(qū)總醫(yī)院的健康自愿者。其中慢性腎病患者血漿樣本60例，正常人血漿樣本30例。

2 儀器與試劑

2.1 儀器

高效液相色譜儀(Agilent1100，配有DAD檢測(cè)器及自動(dòng)進(jìn)樣器)，QF3800氮?dú)獯蹈蓛x(北京華盛譜信儀器有限責(zé)任公司)，H1650-W離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)，TDZ4-WS低速臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司)，-80℃低溫冰箱(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，F(xiàn)rance)，20～200μL和200～1 000μL移液槍(法國(guó)吉爾森公司)，TOF-MS(Agilent TOF G1969A，配有ESI電離源接口)，VORTEX-5渦旋混合器(海門市其林爾儀器制造有限公司)。

2.2 試劑

色譜級(jí)乙腈、甲醇(德國(guó)Merck公司)，色譜級(jí)甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，超純水(18.2 MΩ) 由本實(shí)驗(yàn)室Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore，F(xiàn)rance)制備，其他試劑均為分析純。

3 方法與結(jié)果

3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18column(100mm×4.6mm，2.7μm)，流速為1mL·min-1，分流比為3∶1，柱溫為45 ℃，流動(dòng)相為A：0.1 %甲酸水溶液，B：乙腈，梯度洗脫條件見表1。進(jìn)樣量為4μL，進(jìn)樣高度為4mm。

3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(Dual ESI)，采用正離子模式檢測(cè)。用350℃氣體干燥，流速為9L·min-1；毛細(xì)管電壓為4 000V，霧化器壓力為45psig，Skimmer 為65V；碎裂電壓為125V，OCT 1RF Vpp為250V；采用質(zhì)心模式采集，速率為1.5Spectra/s，m/z50～1050；采用校正混合溶液(Agilent，USA，m/z=121.050 873，922.009 798)作為鎖定質(zhì)量(Lock mass)。

表1 梯度洗脫條件

3.3 血漿樣品處理方法優(yōu)化

3.3.1 沉淀蛋白溶劑考察 LC-MS進(jìn)樣前，要除去樣品中含有的蛋白質(zhì)，不同溶劑對(duì)蛋白質(zhì)的去除效果有所不同，沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)還要盡量保存組分中的其他物質(zhì)，并且使之能充分地溶解在溶劑中。

(1)混合血漿制備：分別精密吸取慢性腎病患者及健康人所有血漿樣本各100μL于樣品管中，混勻，備用。

(2) 供試品溶液制備：分別精密吸取100μL混合血漿樣品各10份于2mL離心管中，分別精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各400μL，渦旋3min，4 ℃下15 000 r·min-1離心15min，用移液槍吸取上層清液，采用氮?dú)獯蹈蓛x吹干后分別精密加入相應(yīng)提取溶劑各100μL，備用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)可達(dá)到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分，結(jié)果見表2。

3.3.2 復(fù)溶溶劑考察 血漿溶液經(jīng)蛋白沉淀后，吸取上層清液，氮?dú)獯蹈珊笮柙龠M(jìn)行復(fù)溶。復(fù)溶溶劑極性的大小是影響被提取成分是否能夠完全溶解的關(guān)鍵因素，假設(shè)甲醇沉淀血漿中蛋白質(zhì)時(shí)，血漿含水量以100%計(jì)，100μL血漿加入甲醇400μL，相當(dāng)于蛋白質(zhì)沉淀溶劑為80%甲醇，為保證樣品能完全溶解，現(xiàn)對(duì)樣品復(fù)溶溶劑進(jìn)行考察。

精密吸取100μL混合血漿樣品10份于2mL離心管中，分別精密加入甲醇400μL，渦旋3min，4℃下15 000r·min-1離心1min，用移液槍吸取上層清液，氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，分別精密加入60%、70%、80%、90%、100%乙腈和60%、70%、80%、90%、100%甲醇各100μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以80%乙腈作為復(fù)溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分，結(jié)果見表3。

表2 沉淀蛋白質(zhì)溶劑用量考察結(jié)果 (μL)

表3 復(fù)溶溶劑用量考察結(jié)果 (μL)

3.3.3 凍融穩(wěn)定性考察 對(duì)同一份血漿樣品分別進(jìn)行凍融1、2和3次處理，每組重復(fù)處理兩次，考察凍融循環(huán)后樣品的穩(wěn)定性，標(biāo)記為1～6，樣品處理方法如上。經(jīng)過不同冷凍循環(huán)處理后的樣品，測(cè)定其所含化合物數(shù)量，并計(jì)算RSD值，均小于15%。結(jié)果表明，樣品經(jīng)不同凍融循環(huán)后，不會(huì)引起統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，樣品凍融穩(wěn)定性良好。

3.3.4 重復(fù)性考察 分別精密吸取慢性腎病及健康人血漿樣品各6份，每份各100μL，精密加入甲醇400μL，渦旋3min，4℃下15 000r·min-1離心15min，用移液槍吸取上層清液，氮?dú)獯蹈蓛x吹干后，精密加入80%乙腈100μL，渦旋3min，4℃下15 000 r·min-1離心15min，吸取上清，即得樣品溶液。測(cè)定所含化合物數(shù)量，并計(jì)算RSD值，均小于15%，結(jié)果見圖1和圖2。結(jié)果表明，該血漿樣品處理方法重復(fù)性良好，可用于腎病血漿代謝組學(xué)研究。

圖1 慢性腎病患者血漿HPLC-TOFMS總離子流

圖2 健康人血漿HPLC-TOFMS總離子流

4 結(jié)論

在代謝組學(xué)研究中，樣品制備過程必須要遵循以下幾項(xiàng)原則：首先要盡量簡(jiǎn)化處理步驟以使樣品中蛋白質(zhì)被完全除去，并能達(dá)到各組分相互分離的效果；在保證樣品各組分相對(duì)濃度穩(wěn)定的同時(shí)盡可能避免樣品中待測(cè)物流失；處理方法應(yīng)具有良好的重復(fù)性。因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)法在分析樣品前將血漿中的蛋白質(zhì)盡可能地除去，再對(duì)其進(jìn)行LC-MS分析。在沉淀蛋白質(zhì)的同時(shí)，要最大限度地保留血漿中的小分子化合物，使其充分溶解在有機(jī)溶劑中，盡量減少待分析組分因蛋白沉淀而造成損失。沉淀蛋白質(zhì)的過程尤為重要，需對(duì)沉淀溶劑進(jìn)行考察。本研究對(duì)代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)血漿樣品的制備方法及其測(cè)定條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化，得到全面精確、可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

本研究對(duì)血漿前處理方法的沉淀溶劑及復(fù)溶溶劑進(jìn)行了考察，結(jié)果表明該方法有效、可行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用甲醇沉淀蛋白質(zhì)對(duì)慢性腎病患者及健康人血漿均可達(dá)到較好的除蛋白效果，并且可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分；用80%乙腈作為復(fù)溶溶劑可最大限度地保留血漿中的待測(cè)組分。此外，對(duì)凍融穩(wěn)定性及重復(fù)性進(jìn)行考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，在3次凍融循環(huán)之內(nèi)，提取的化合物數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明凍融穩(wěn)定性效果良好；分別對(duì)慢性腎病組及健康組患者血漿樣品進(jìn)行重復(fù)性考察，結(jié)果顯示該方法重復(fù)性良好。

綜上所述，該方法操作簡(jiǎn)單，盡可能保留了血漿樣品中的小分子化合物，符合代謝組學(xué)高通量研究的基本要求。在尋找慢性腎病患者與健康人血漿中差異物的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討慢性腎病患者的發(fā)病機(jī)制，為今后臨床治療慢性腎病奠定基礎(chǔ)。

[1] TAYLOR J,KING R,FIEHIN O.Application of metabolomics to plant genotype discrimination using statistics and machine learning[J].Bioinformatics,2002,18(10):S241-S248.

[2] CHEN JING,LU XIN,XU GUOWANG,et al.A metabonomics approach based on liquid chromatography-mass spectrometry:from metabolic profiling to potential biomarker[J].Science in China Series B Chemistry,2009,39(17):1268-1276.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Optimization of Disposal Method of Treated Plasma Samples Before Analysis of Metabolism in Chronic Kidney Disease Patients

Zhao Jing1,Guan Xin2,Bao Yongrui1,Wang Shuai1,Meng Xiansheng1*,Zheng Hongguang2，*

(1.Pharmaceatic of Liaoning Univresity of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600,China;2.General Hospital of Shenyang Military Region of PLA,Shenyang 110016,China)

Objective:Patients with chronic kidney disease on plasma sample preparation method metabolomics analysis before optimization.Methods:HPLC/TOF-MS technology for 60 cases of patients with chronic kidney disease and 30 healthy volunteers plasma research.Results:Experi-mental results show that the protein precipitation with methanol,chronic kidney disease patients and healthy addition to human plasma proteins can achieve better results， and can maximize the retention of analytes in plasma,with 80% acetonitrile as a solvent reconstitution can be plasma maximize the retention of analytes.Conclusion:the established for metabonomics optimization method for sample treatment before analysis using HPLC/TOF-MS technology.To lay the foundation for the study of plasma metabonomics．

Chronic Kidney Disease; Plasma; LC-MS;Sample Preparation

2014-09-10

趙靜(1988-)，女，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬锓治黾奥阅I病代謝組學(xué)。

孟憲生，男，博士，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量分析，E-mail:mxsvvv@126.com；鄭紅光，男，博士，中國(guó)人民解放軍沈陽軍區(qū)總醫(yī)院主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟I病臨床診療，E-mail:phd528@163.com。

Q936

A

1673-2197(2015)02-0031-03

10.11954/ytctyy.201502012