β－受體激動(dòng)劑質(zhì)譜裂解特征研究

應(yīng)永飛朱聰英周 煒屈 健陸春波汪以真

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，杭州310020）

β－受體激動(dòng)劑質(zhì)譜裂解特征研究

應(yīng)永飛1，2，朱聰英2，周 煒2，屈 健2，陸春波2，汪以真1

（1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浙江省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，杭州310020）

以克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇為代表，闡明了β－受體激動(dòng)劑在正離子軟電離模式下的裂解機(jī)理。采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級(jí)桿電噴霧質(zhì)譜儀，運(yùn)用IDA－EPI技術(shù)，對(duì)β－受體激動(dòng)劑類化合物裂解規(guī)律進(jìn)行研究解析。結(jié)果表明，在ESI正電離模式下β－受體激動(dòng)劑容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰，該結(jié)構(gòu)易丟失水分子（H2O，繼而與氨基結(jié)構(gòu)相連的碳氮鍵（－C－N－）發(fā)生斷裂，形成與苯環(huán)共軛的（Ph－CH＝CH－NH＋－）離子結(jié)構(gòu)。本研究為同類化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了可靠依據(jù)以及跟蹤新型β－受體激動(dòng)劑提供了有力手段。

β－受體激動(dòng)劑；質(zhì)譜裂解；液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法

β－受體激動(dòng)劑是一種化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類化合物，因該類物質(zhì)可以加快畜禽生長(zhǎng)，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率，曾被作為促生長(zhǎng)劑在飼料和飲水中添加使用［1］。由于該類化合物易在動(dòng)物組織中形成殘留，人們食用后曾多次發(fā)生中毒事件，所以我國(guó)已全面禁止該類化合物作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑在動(dòng)物養(yǎng)殖中使用［2］。但是，由于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，目前仍被少數(shù)不法分子非法添加到飼料中，且近年來(lái)新型藥物不斷出現(xiàn)［2］，因此需要對(duì)β－受體激動(dòng)劑進(jìn)行有效的檢測(cè)和監(jiān)控。

質(zhì)譜圖是化合物結(jié)構(gòu)的直觀反映［3］，質(zhì)譜分析

具有檢測(cè)速度快、靈敏度高和樣品耗費(fèi)少等優(yōu)點(diǎn)，已成為復(fù)雜體系中痕量組分分析的一種重要方法［4］。 雖然有關(guān)動(dòng)物尿液［5－6］、牛奶［7］、動(dòng)物組織［8－9］β－受體激動(dòng)劑檢測(cè)的文獻(xiàn)已有大量報(bào)道，但是，針對(duì)其質(zhì)譜裂解機(jī)理研究的文獻(xiàn)鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，且以Q－TOF等高分辨質(zhì)譜檢測(cè)方法為主［10－11］。本研究采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級(jí)桿－線性離子阱電噴霧質(zhì)譜儀，通過(guò)調(diào)節(jié)源內(nèi)碰撞裂解（源內(nèi)CID）能量，繼而利用三重四級(jí)桿－線性離子阱實(shí)現(xiàn)準(zhǔn) MS／MS／MS［12］，對(duì)克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇3種化合物的裂解行為進(jìn)行了考察，分別代表苯胺型、苯酚型和水楊酸型三種結(jié)構(gòu)，研究它們?cè)谡x子軟電離狀態(tài)下的裂解行為。本研究為同類化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了可靠依據(jù)，為跟蹤新型β－受體激動(dòng)劑提供了有力手段，具有較強(qiáng)的理論意義和實(shí)用價(jià)值（圖1）。

圖1 三種β－受體激動(dòng)劑化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1290N 高效液相色譜儀（Agilent公司，美國(guó)），AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級(jí)桿－線性離子阱電噴霧質(zhì)譜儀（ABSCIEX公司，美國(guó)），配電噴霧離子源（ESI）；Hamilton 1000 μL注射器 （Hamilton 公 司，美 國(guó)）；MS3minishaker旋渦混勻器（IKA公司，德國(guó)）；XS－205電子天平（METTLER公司，瑞士）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試劑 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)品（Dr.Ehrenstorfer公司，德國(guó)）；甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純（Merck公司，美國(guó)）；實(shí)驗(yàn)用水為Milli－Q超純水。

1.3 質(zhì)譜條件與方法 離子源：電噴霧離子源；監(jiān)測(cè)模式：正離子掃描模式；離子源電壓為5500 V；輔助加熱氣溫度為500℃；氣簾氣流速為40 L／h；脫溶劑氣流速為中等；霧化氣和輔助氣均為45 L／h；質(zhì)量全掃描范圍為m／z50～450。試驗(yàn)方法包括：進(jìn)樣方式為注射器直接進(jìn)樣，流速為5 μL／min；碰撞氣為N2。同時(shí)利用源內(nèi)CID對(duì)準(zhǔn)分子離子［M＋H］＋進(jìn)行MS2分析，然后再對(duì)產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)一步進(jìn)行四極桿－線性離子阱CID（MS3）分析，結(jié)合IDA－EPI掃描，獲得相應(yīng)的子離子質(zhì)譜圖，進(jìn)行待測(cè)物的裂解特征研究。

1.4 樣品制備 分別稱取克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用甲醇配制成濃度均為1.0 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確量取1.0 mL儲(chǔ)備液分別置于100 mL容量瓶中，用甲醇配制成濃度均為10 μg／mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。分別取20 μL標(biāo)準(zhǔn)中間液，用0.1%甲酸溶液／甲醇（9∶1，V／V）稀釋至1 mL，三種β－受體激動(dòng)劑標(biāo)準(zhǔn)工作液的最終濃度為200 ng／mL，用注射器直接進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 克倫特羅的裂解特征解析 由圖2可以發(fā)現(xiàn)，克倫特羅的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋為m／z277、279、281，其豐度比約為9∶6∶1，這與每個(gè)分子中含有2個(gè)Cl原子的結(jié)構(gòu)一致，與文獻(xiàn)報(bào)道吻合［3］。因m／z277靈敏度最高，作為母離子對(duì)其進(jìn)行子離子掃描CID（MS2），結(jié)果產(chǎn)生了m／z259、203、168和132等碎片離子。其中，m／z259對(duì)應(yīng)于［M＋H－18］＋，通過(guò)比較兩離子之間質(zhì)量差值，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子。由m／z259碎片離子經(jīng)結(jié)構(gòu)重排后，失去（2－甲基丙烯）得到m／z203的特征碎片。而m／z168與m／z203質(zhì)量數(shù)相差35，這恰好為Cl原子的質(zhì)量，故可確認(rèn)它是脫去氯自由基（Cl·）后形成的碎片，m／z168進(jìn)一步丟失m／z36（HCl）形成碎片離子m／z132。進(jìn)一步對(duì)主要子離子m／z203進(jìn)行源內(nèi)CID（MS3）分析，其準(zhǔn)三級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，結(jié)果生成了m／z168和132碎片，與MS2結(jié)果一致，其可能裂解途徑見(jiàn)圖4。

圖2 三種β－受體激動(dòng)劑［M＋H］＋離子的ESI－MS2圖譜

圖3 三種β－受體激動(dòng)劑［M＋H］＋離子的ESI－MS3圖譜

圖4 克倫特羅［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

2.2 沙丁胺醇的裂解特征解析 由圖2可以發(fā)現(xiàn)，沙丁胺醇的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋為m／z240，作為母離子對(duì)其進(jìn)行子離子掃描CID（MS2），結(jié)果產(chǎn)生了m／z222、204、166和148等碎片離子。其中，m／z222相應(yīng)于［M＋H－18］＋，通過(guò)比較兩離子之間質(zhì)量差值，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子，因沙丁胺醇的水楊酸結(jié)構(gòu)，苯甲醇結(jié)構(gòu)再脫去一個(gè)H2O分子（m／z18），得到碎片離子m／z204。由m／z222碎片離子經(jīng)結(jié)構(gòu)重排后，失去2－甲基丙烯（m／z56）得到m／z166的特征碎片。而m／z166與再脫去一個(gè)H2O分子（m／z18）得到碎片離子m／z148。進(jìn)一步對(duì)主要子離子m／z222進(jìn)行源內(nèi)CID（MS3）分析，其準(zhǔn)三級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，結(jié)果生成了m／z204、166和148碎片，與MS2結(jié)果一致，其可能裂解途徑見(jiàn)圖5。相對(duì)于苯胺型和苯酚型的β－受體激動(dòng)劑，水楊酸型結(jié)構(gòu)的沙丁胺醇的裂解過(guò)程比較典型，也更具有代表性。

2.3 萊克多巴胺的裂解特征解析 由圖2可以發(fā)現(xiàn)，萊克多巴胺的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋為m／z302，作為母離子對(duì)其進(jìn)行子離子掃描CID（MS2），結(jié)果產(chǎn)生了m／z284、164、136和121、107、91等碎片離子。通過(guò)比較兩離子之間質(zhì)量差值，m／z284相應(yīng)于［M＋H－18］＋，確定脫去的碎片（m／z18）為H2O分子。采用源內(nèi)進(jìn)一步對(duì)主要子離子m／z284、164、136進(jìn)行源內(nèi)CID（MS3）分析，其準(zhǔn)三級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)m／z284→m／z164→m／z121具有相關(guān)性，而m／z284不能直接產(chǎn)生m／z136、107等碎片離子，故這些離子可能由準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋m／z302直接產(chǎn)生。

由于萊克多巴胺氨基左右結(jié)構(gòu)基本對(duì)稱，故而碎片離子較為豐富，為結(jié)構(gòu)鑒定提供了足夠信息，其可能裂解途徑見(jiàn)圖6。

圖5 沙丁胺醇［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

圖6 萊克多巴胺［M＋H］＋離子可能的ESI－MS2裂解途徑

3 討論

電噴霧電離是一種軟電離技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)在于容易得到相對(duì)分子質(zhì)量的信息，但軟電離技術(shù)所生成的準(zhǔn)分子離子過(guò)剩的內(nèi)能較少，往往產(chǎn)生的碎片離子很有限。而三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器的工作原理是先測(cè)得準(zhǔn)分子離子，然后選中該離子通過(guò)適當(dāng)碰撞誘導(dǎo)解離能量將其打碎，從而獲得更多的結(jié)構(gòu)信息，因此，電噴霧結(jié)合三重四級(jí)桿質(zhì)量分析器是結(jié)構(gòu)分析的理想選擇。

3.1 一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析 采用電噴霧離子源，在正離子監(jiān)測(cè)模式下對(duì)三種β－受體激動(dòng)劑進(jìn)行質(zhì)譜分析。在一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析中，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇均檢測(cè)到信號(hào)很強(qiáng)的準(zhǔn)分子離子峰［M＋H］＋（均為基峰）。推測(cè)這可能與化合物本身結(jié)構(gòu)有關(guān)，此類化合物含有氨基（－NH）結(jié)構(gòu)，易與質(zhì)子結(jié)合形成季銨鹽的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，故加合峰響應(yīng)值很高。

3.2 質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析及裂解規(guī)律研究 為了研究分子結(jié)構(gòu)與裂解途徑之間的關(guān)系，分別對(duì)三種β－受體激動(dòng)劑的［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行CID分析，從低到高調(diào)節(jié)適宜的碰撞能量，使其［M＋H］＋峰產(chǎn)生穩(wěn)定的碎片離子，探討該類化合物的質(zhì)譜裂解途徑。

由于β－受體激動(dòng)劑均屬于苯乙醇胺類化合物，具有基本骨架相同、結(jié)構(gòu)類似的特點(diǎn)，但苯環(huán)上及氨基連接官能團(tuán)有差異，所以它們的ESI－MS／MS行為應(yīng)存在著相似性和差異性。通過(guò)比較化合物的結(jié)構(gòu)信息和質(zhì)譜信息，發(fā)現(xiàn)它們?cè)谲涬婋x狀態(tài)下均存在丟失中性分子H2O的裂解途徑。同時(shí)利用源內(nèi)CID對(duì)［M＋H］＋離子進(jìn)行MS2分析，然后對(duì)產(chǎn)生的碎片離子進(jìn)一步進(jìn)行四極桿－線性離子阱CID（MS3）分析，獲得相應(yīng)的子離子質(zhì)譜圖。

3.3 電噴霧電離的裂解方式 電噴霧電離作為一種軟電離技術(shù)，通常易于丟失中性小分子，進(jìn)而生成穩(wěn)定性較高的離子，本試驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。因β－受體激動(dòng)劑都含有苯乙醇胺的母體結(jié)構(gòu)，所以在ESI正電離模式下容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰，該結(jié)構(gòu)易丟失H2O等中性分子，以水楊酸型的β－受體激動(dòng)劑最為典型。該類化合物氨基結(jié)構(gòu)相連的（－C－N－）鍵容易斷裂，產(chǎn)生與苯環(huán)共軛的（Ph－CH＝CH－NH－）離子結(jié)構(gòu)。這兩對(duì)子離子的豐度較高，易于檢測(cè)，可作為此類化合物及其衍生物定性分析中的“診斷”離子。

3.4 含氯化合物的裂解規(guī)律探討 除克倫特羅外，克倫塞羅、氯丙那林等很多β－受體激動(dòng)劑藥物結(jié)構(gòu)中都含有Cl原子，因此質(zhì)譜圖中有氯化物特征同位素峰的出現(xiàn)，這是由于自然界中37Cl與35Cl的天然豐度之比約為1∶3。這種特征為此類藥物的定性分析和碎片歸屬提供了極為有用的依據(jù)。由于此類藥物結(jié)構(gòu)中的 Cl原子與苯環(huán)直接相聯(lián)，屬于芳香族氯化物，所以裂解時(shí)Cl原子以中性自由基方式異裂［13］，顯示出［M＋H－Cl］＋強(qiáng)峰，提供了典型碎片離子。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用AB SCIEX 5500 QTRAP三重四級(jí)桿電噴霧質(zhì)譜儀，對(duì)三種代表性β－受體激動(dòng)劑質(zhì)譜裂解機(jī)理進(jìn)行了研究，對(duì)其中可能的解離途徑進(jìn)行了解析。在ESI正電離模式下，β－受體激動(dòng)劑容易獲得H＋而形成［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰，該結(jié)構(gòu)易丟失H2O等中性分子，而與氨基結(jié)構(gòu)相連的（－CN－）鍵容易斷裂，產(chǎn)生與苯環(huán)共軛的（Ph－CH＝CHNH＋－）離子結(jié)構(gòu)。鑒于β－受體激動(dòng)劑苯乙醇胺類化學(xué)結(jié)構(gòu)的類似性，本研究也為其他β－受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜解析提供了理論依據(jù)。

［1］應(yīng)永飛，朱聰英，陳慧華，等.多壁碳納米管分散固相萃取結(jié)合LC－MS／MS測(cè)定飼料中11種β－受體激動(dòng)劑［J］.中國(guó)畜牧雜志，2013，49（9）：68－73.

［2］中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部公告第1519號(hào)［S］.

［3］李 馨，王英武，顧景凱，等.三唑侖苯二氮卓類藥物的電噴霧質(zhì)譜裂解特征［J］.分析化學(xué)，2003，31（9）：1105－1108.

［4］郭澤琴，霍佳麗，王建華，等.β－內(nèi)酰胺類抗生素質(zhì)譜裂解機(jī)理研究［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2014，35（1）：45－51.

［5］Williams L D，Churchwell M I，Doerge D R.Multiresidue confir?mation of β－agonists in bovine retina and liver using LC－ES／MS／MS［J］.J Chromatogr B，2004，813（1／2）：35－45.

［6］Nielen M W F，Lasaroms J J P，Essers M L，et al.Multiresidue analysis of beta－agonists in bovine and porcine urine，feed and hair using liquid chromatography electrospray ionisation tandem mass spectrometry［J］.Anal Bioanal Chem，2008，391（1）：199－210.

［7］Li C，Wu Y L，Yang T，et al.Simultaneous determination of clenbuterol，salbutamol and ractopamine in milk by reversedphase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution［J］.J Chromatogr A， 2010， 1217（50）：7873－7877.

［8］吳平谷，應(yīng)永飛，陳慧華，等.同位素稀釋結(jié)合固相萃取快速測(cè)定動(dòng)物組織中 β2－興奮劑［J］.分析化學(xué)，2007，35（3）：330－334.

［9］Zhang X Z，Gan Y R，Zhao F N.Determination of clenbuterol in pig liver by high－performance liquid chromatography with a coulometricelectrode array system［J］.Anal Chim Acta，2003，（489）：95－101.

［10］Wang X J，Zhang F，Ding F，et al.Simultaneous determination of 12 β－agonists in feeds by ultra－h(huán)igh－performance liquid chromatography－quadrupole－time－of－flight mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2013，1278：82－88.

［11］王英武，顧景凱，王 玲，等.電噴霧電離－四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法研究三種β2－受體激動(dòng)劑的質(zhì)譜裂解特征［J］.質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2004，25（2）：69－72.

［12］焦豪妍，許風(fēng)國(guó)，田 媛，等.氟喹諾酮類化合物電噴霧質(zhì)譜裂解規(guī)律［J］.中國(guó)抗生素雜志，2009，34（6）：344－347.

［13］陳耀祖，涂亞平.有機(jī)質(zhì)譜原理及應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：149－150.

（編輯：侯向輝）

Study on Mass Spectral Characteristics of β－receptor Agonists

YING Yong－fei1，2，ZHU Cong－ying2，ZHOU Wei2，QU Jian2，LU Chun－bBo2，WANG Yi－zhen1
（1.College of Animal Sciences，Zhejiang University，Hangzhou310058，China；2.Animal Products Quality Testing Centre of Zhejiang Province，Hangzhou310020，China）

To clarify pyrolysis mechanism of β－receptor agonists under positive mode，representative drugs including clenbuterol，salbutamol and ractopamine had been chosen to study with AB SCIEX 5500 QTRAP triple quadrupole mass spectrometry and IDA－EPI technology.The results showed that under ESI positive mode，βreceptor agonists were easy to form ［M＋H］＋.The structure was easy to loss neutral molecules，such as H2O.Moreover，the C－N bond connected with amino group was easy to broken and produce conjugated ion structure with benzene.This study had important theory research significance and practical value，such as providing reliable basis for other β－receptor agonists structural analysis and providing powerful means to track new β－receptor agonists.

β－receptor agonists；mass spectral characteristics；liquid chromatography－tandem mass spectrometry

2014－10－14

A

1002－1280（2015）01－0052－06

S859.83

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201203023－4）

應(yīng)永飛，博士，從事飼料安全檢測(cè)研究。E－mail：yyf1001＠163.com