柿子單寧對體外模擬發(fā)酵環(huán)境中腸道微生物的影響

林 款，李春美

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

柿子單寧對體外模擬發(fā)酵環(huán)境中腸道微生物的影響

林 款，李春美*

（華中農業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢430070）

采用體外厭氧發(fā)酵法研究了柿子單寧對腸道微生物的影響。將單寧與大鼠腸道微生物共孵育，分別測定0、6、12、24、48 h五個時間點發(fā)酵液中六種微生物、短鏈脂肪酸和pH的變化。結果顯示，與空白組相比，添加2 g/L劑量組的柿單寧能有效地促進腸道有益菌（乳桿菌和雙歧桿菌）的增殖，抑制有害菌（腸球菌、大腸桿菌、梭菌和擬桿菌）的增殖，增加短鏈脂肪酸含量，降低發(fā)酵液pH。研究結果表明柿子單寧對腸道微生態(tài)具有調節(jié)作用，可能是其在體內發(fā)揮作用的機制之一。

柿子單寧，體外發(fā)酵，腸道微生物

多酚化合物是廣泛存在于水果、茶、咖啡、葡萄酒和谷物中的一類次級代謝產(chǎn)物[1]，對心腦血管疾病和腸道健康具有調節(jié)保護作用[2]。具有能有效消除自由基、促進腸胃消化、降血脂、增強人體免疫力、預防動脈硬化等多種功能[3]。此外，多酚類化合物對金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等致病菌均有明顯的抑制作用[4]。

眾多的研究表明柿單寧在體內外均具有較強的降血脂、抗氧化、抗炎等作用[3-5]。但由于柿子單寧的高度聚合，一般難以被機體吸收利用，其在體內發(fā)揮健康作用的途徑和機制尚不清楚。越來越多的研究表明人體腸道菌群健康與各種疾病的發(fā)生具有密切聯(lián)系[6]，腸道微生物可利用碳水化合物和蛋白質產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸，其中雙歧桿菌（Bifidobacterium）主要產(chǎn)乙酸和乳酸，乳桿菌（Lactobacillus）產(chǎn)生的乳酸以及擬桿菌（Bacteroides）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）產(chǎn)生的丁酸，能形成微酸性的pH環(huán)境，抑制腐敗菌的生長，改善腸道微環(huán)境，促進機體健康[7]。大量的研究表明，多酚類化合物可通過調節(jié)腸道微生物的組成，發(fā)揮其健康調節(jié)作用。目前研究的比較多的茶多酚、紅酒多酚可以通過抑制病原微生物的生長和促進有益菌群的增殖，從而有效地調節(jié)腸道菌群的健康[8-10]。一些結構較為簡單的天然多酚類化合物通過降解成活性更強的代謝物，從而提高了生物利用率[11]。然而，對于結構復雜的高聚多酚類化合物對腸道健康的調節(jié)鮮見研究報道。

體外發(fā)酵作為動物實驗的補充可以跟蹤發(fā)酵過程中物質的變化及研究發(fā)酵產(chǎn)物的形成過程，彌補了體內發(fā)酵不能實現(xiàn)動力學檢測的缺點[12]。因此，本研究擬利用體外厭氧發(fā)酵方式對分離純化得到的柿子單寧進行混合發(fā)酵培養(yǎng)，通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)法分析厭氧發(fā)酵48 h中有益菌和有害菌的數(shù)量變化，利用氣相色譜分析產(chǎn)短鏈脂肪酸的情況以及對應的pH變化，研究其對調節(jié)腸道微生態(tài)的作用。旨在為探討高度聚合的多酚在體內發(fā)揮藥理活性的可能機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD雄性大鼠 許可證號：SCXK（鄂）2008-0005，購自湖北省實驗動物中心；恭城月柿 購自水果湖水果批發(fā)市場；含氮培養(yǎng)基各試劑成分 均購自上海源葉生物公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基、BBL瓊脂培養(yǎng)基、EMB瓊脂培養(yǎng)基、腸球菌瓊脂培養(yǎng)基、DRCA瓊脂培養(yǎng)基、BBE瓊脂培養(yǎng)基 均購自青島海博生物公司；乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸標準品 均購自阿拉丁試劑網(wǎng)。

YQX系列厭氧培養(yǎng)箱 購自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；凈化工作臺 購自蘇州凈化設備有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 購自天津市泰斯特儀器公司；壓力蒸汽滅菌鍋 購自上海三申醫(yī)療器械有限公司；氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司；pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 柿子單寧的提取 采收成熟恭城月柿，利用含有1%鹽酸的無水甲醇提取柿子果肉中的單寧，將250 g柿子切碎按料液比為1∶8加入2000 mL無水甲醇，在80℃水浴槽中經(jīng)過三次冷凝回流合并提取液，35℃條件下旋蒸濃縮去掉溶劑后得到粗提液，置于AB-8大孔樹脂吸附40 min，純水洗至無糖，再用10%的乙醇去掉低分子量酚類化合物，最后用1 L 95%的乙醇洗脫，收集洗脫液旋轉濃縮[3]，冷凍干燥后得到聚合度范圍在19～47的柿子單寧[13]，置于-20℃冰箱保存。

表1 發(fā)酵液配比Table 1 Compounds of each fermentation liquid

1.2.2 體外厭氧發(fā)酵 稱取柿子單寧樣品溶解于高壓滅菌后的含氮基礎培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為：1 L超純水含有蛋白胨2 g、酵母膏2 g、NaCl 0.1 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2·7H2O 0.01 g、NaHCO32 g、氯化血紅素0.05 g、L-半胱氨酸0.5 g、膽汁酸鹽0.5 g、吐溫80 2 mL、維生素K 110 μL；0.025 g/100 mL刃天青4 mL，pH調至7.0[14]。取SD大鼠盲腸內容物制成糞便樣液（10%、pH7.3的PBS）2 mL懸浮于100 mL含有不同濃度柿單寧的底物培養(yǎng)基溶液中，體外發(fā)酵液配比見表1?；旌暇鶆蚝蠓湃?yún)捬跖囵B(yǎng)箱（10% H2、10%CO2、80%N2）中，37℃厭氧發(fā)酵培養(yǎng)。在培養(yǎng)時間為0、6、12、24、48 h時分別取樣液，供細菌培養(yǎng)計數(shù)和短鏈脂肪酸含量檢測。

1.2.3 生化指標檢測

1.2.3.1 發(fā)酵液微生物測定 取發(fā)酵液1 mL，加入9 mL無菌生理鹽水，依次10倍稀釋至10-8，采用傾注法進行傳統(tǒng)平板培養(yǎng)。選擇三個合適稀釋度，用于雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳桿菌（Lactobacillus）、腸球菌（Enterococci）、大腸桿菌（Escherichia coli）、擬桿菌（Bacteroides）和梭菌（Clostridium bacteria）的培養(yǎng)計數(shù)，培養(yǎng)基選用各種菌的選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)方法如表2所示。最后以各單寧組菌落數(shù)的以10為底的對數(shù)與空白組菌落數(shù)的以10為底的對數(shù)的差值（用N表示）為指標，分析柿單寧對目標菌的影響。

表2 目標菌培養(yǎng)方法Table 2 Methods of target bacteria culture

1.2.3.2 發(fā)酵液短鏈脂肪酸測定 取2 mL發(fā)酵液樣品分別置于2個離心管中，4℃低溫15000 r/min，離心20 min，各吸取上清0.5 mL收集到另一干凈離心管中，加入25%的偏磷酸200 μL，渦旋振蕩1 min，充分混勻，置于4℃冰箱12 h，再次在15000 r/min、4℃離心20 min，收集上清液到另一干凈離心管中，用于氣相色譜分析。

氣相色譜條件：載氣：N2，流速1.5 mL/min；進樣口：不分流進樣口，進樣時間1.2 min，溫度250℃；檢測器：FID檢測器，溫度300℃；柱溫：100℃保留3 min，以5℃/min速度升至140℃，然后以50℃/min升至200℃，保留3 min；H2流速40 mL/min；空氣流速400 mL/min；尾吹氣為N2，30 mL/min；色譜柱：DBFFAP 30 m×250 μm×0.25 μm。

1.2.3.3 pH測定 取發(fā)酵液樣品2 mL于4000 r/min下離心5 min，吸取上清液1 mL，稀釋至10 mL，用pH計測上清液pH。

1.2.4 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計學分析采用SPSS 19.0軟件進行，實驗結果以平均值±標準差表示，各組結果采用LSD顯著性差異測驗進行單向方差分析，顯著水平為0.05，極顯著水平為0.01。

2 結果與討論

2.1 發(fā)酵液中微生物的變化

柿子單寧對腸道微生物發(fā)酵液中各類菌的影響結果見圖1。其中Lab表示乳桿菌（Lactobacillus）、Bif表示雙歧桿菌（Bifidobacterium）、Ent表示腸球菌（Enterococci）、E.coli表示大腸桿菌（Escherichia coli）、Bac表示擬桿菌（Bacteroides）、Clo表示梭菌（Clostridium bacteria）。

圖1 不同發(fā)酵時間柿單寧濃度對不同腸道菌群微生物數(shù)量的影響Fig.1 Influence of different concentrations of persimmon tannin on in the bacterial population at different time during the fermentation

與空白組相比，添加2 g/L的單寧在48 h時對乳桿菌和雙歧桿菌都有顯著（p＜0.05）的促進作用，而對有害的腸球菌、大腸桿菌和梭菌的抑制作用較小，對擬桿菌有顯著（p＜0.05）的抑制作用；添加4 g/L的單寧對乳桿菌和雙歧桿菌的增殖并沒有顯著的影響，而對四種有害菌的抑制作用有所增強；添加8 g/L的單寧對人體這兩種有益菌具有顯著（p＜0.05）的抑制生長作用，在發(fā)酵開始階段最為明顯，12 h后對腸球菌、大腸桿菌、梭菌和擬桿菌的抑制作用與比其他組相比更加明顯。從整體分析，單寧對乳桿菌和雙歧桿菌的促進和抑制作用與添加劑量密切相關，2 g/L的單寧添加量對這兩種有益菌的促進效果最好，隨著劑量的逐漸增加，當達到8 g/L的單寧添加量時兩種有益菌則呈現(xiàn)出明顯的負增長趨勢。柿子單寧對發(fā)酵液中腸球菌、大腸桿菌、梭菌和擬桿菌均有明顯的抑制作用，并且隨著單寧添加劑量的增大，表現(xiàn)出明顯的劑量效應關系。

文獻報道石榴苷在有效調節(jié)腸道菌群的作用濃度為1 g/L[14]，作用效果優(yōu)于柿子單寧，而茶多酚的有效作用濃度為2 g/L[15]，與柿子單寧的作用效果相當。有報道植物多酚提取物能促進雙歧桿菌和乳酸菌在腸道內的定殖，從而競爭性地抑制病原菌在腸道內的黏附、定殖和繁殖[16-17]。腸道內雙歧桿菌和乳酸菌等有益菌數(shù)量的增加可以更加有效地減少氨以及前致癌物質的形成[18]，增加有機酸的產(chǎn)生，降低結腸及糞便的pH，抑制病原菌的生長繁殖，從而改善腸道的微環(huán)境，促進人體的健康[19]。

表3 柿單寧對發(fā)酵過程中四種短鏈脂肪酸含量的影響Table 3 Effect of persimmon tannin on the concentration of SCFA in fermentation liquids

2.2 發(fā)酵液中短鏈脂肪酸的變化

添加柿子單寧對發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸的產(chǎn)量產(chǎn)生了影響，如表3中所示，在發(fā)酵12 h后2 g/L單寧處理組乙酸的含量始終維持最高水平，空白組乙酸含量僅次于2 g/L單寧組，而8 g/L單寧處理組乙酸含量最低且變化不大，這是由于腸道中的大部分菌如雙歧桿菌、擬桿菌和梭菌對乙酸的產(chǎn)生都有貢獻[20]。2 g/L單寧處理組在24～48 h之間雙歧桿菌顯著增加，而擬桿菌和梭菌減少，導致了乙酸含量的增加，而8 g/L單寧處理組的各種菌都顯著減少，導致了乙酸含量維持在一個較低水平。丙酸在發(fā)酵6 h時含量最高，然后逐漸下降，24 h后8 g/L單寧處理組丙酸含量下降，空白組和2、4 g/L柿單寧組在24 h后丙酸含量升高，其中2 g/L單寧處理組丙酸含量始終高于其他三組。這是由于丙酸主要是由梭菌產(chǎn)生[20]，2 g/L單寧組對梭菌的抑制作用最小，隨柿單寧劑量的增大對梭菌的抑制作用增強，所以丙酸的含量隨柿單寧劑量的增大而降低。在發(fā)酵24 h后4 g/L單寧處理組正丁酸含量最高，發(fā)酵12 h后2 g/L單寧處理組異丁酸含量最高，而8 g/L單處理寧組在發(fā)酵12 h后異丁酸含量逐漸降低，其他三組在發(fā)酵24 h后正丁酸和異丁酸均有所增大。丁酸對應的產(chǎn)生菌主要是擬桿菌和梭菌[20]，8 g/L單寧處理組對這兩種菌抑制作用顯著，因此8 g/L單寧組正丁酸和異丁酸含量最低。發(fā)酵后期由于營養(yǎng)物質的消耗，腸道微生物開始利用有機酸來生長繁殖，導致有些組在發(fā)酵后期短鏈脂肪酸的含量呈現(xiàn)下降趨勢。通過增加腸道中有益菌的生長和抑制有害菌的生長，改變腸道微生物的組成，可以發(fā)酵產(chǎn)生更多的短鏈脂肪酸，從而有效促進腸道微生態(tài)的健康[21]。

2.3 發(fā)酵液中pH的變化

從圖2中可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，各組發(fā)酵液的pH都在明顯降低（p＜0.05），發(fā)酵24 h時2、4、8 g/L單寧組的pH極顯著低于空白組（p＜0.01），24 h后，各組發(fā)酵液的pH基本維持不變甚至有微量的增加，其中4、8 g/L單寧組在發(fā)酵后期始終維持較低的pH（p＜0.05）。

圖2 單寧對發(fā)酵液pH的影響Fig.2 Effect of tannin on pH in fermentation liquids

這是由于單寧樣品通過腸道微生物的代謝會產(chǎn)生不同類型的酸性物質如短鏈脂肪酸，從而影響發(fā)酵液的pH。隨著發(fā)酵的進行，腸道菌群在發(fā)酵液中產(chǎn)生了各種有機酸，降低了發(fā)酵液的pH，因此在發(fā)酵過程的各個時段，添加單寧實驗組的pH始終低于空白對照組。24 h后由于營養(yǎng)物質的消耗和菌體的生長受到限制，發(fā)酵液的pH沒有下降反而是有所增加。實驗結果中24 h和48 h相比，各類短鏈脂肪酸都有明顯的增加，而對應的發(fā)酵液pH沒有很明顯的降低，分析原因可能是隨著發(fā)酵時間的增長，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質被消耗，腸道微生物的生長利用了一部分的有機酸。

3 結論

本研究結果表明，添加量為2 g/L的柿單寧對乳桿菌和雙歧桿菌這兩類有益菌增殖有促進作用，高劑量的8 g/L柿單寧對有益菌具有抑制生長的作用，而對有害菌的抑制作用是隨著柿子單寧劑量的增加而增大，向發(fā)酵液中添加柿單寧改變了腸道微生物的組成。發(fā)酵培養(yǎng)液中的多糖和蛋白質類在腸道各種微生物的相互作用下，發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸短鏈脂肪酸，隨著腸道中各類微生物數(shù)量的變化，短鏈脂肪酸的含量也發(fā)生了變化。雙歧桿菌的增加導致了乙酸含量的增加，而擬桿菌和梭菌的抑制生長導致在發(fā)酵后期8 g/L單寧組中丙酸、丁酸含量最低。因此柿子單寧對于腸道微生態(tài)具有一定的健康調節(jié)作用，但對腸道微生物的作用機制還有待進一步的研究。

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Effect of persimmon tannin on gut microflora in vitro fermentation environments

LIN Kuan，LI Chun-mei*
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

In the present study，we investigated the effect of persimmon tannin on the intestinal microbial by anaerobic fermentation in vitro，and the changes of microbials，the content of short-chain fatty acids and pH in fermentation broth were measured at 0，6，12，24，48 h，respectively.The results showed that incubating of persimmon tannin（2 g/L）with the intestinal microorganisms promoted proliferation of intestinal bacteria（Lactobacillus and Bifidbacterium）siginificantly，inhibited the proliferation of harmful bacteria（Enterococci，E.coli，Clostridium bacteria and Bacteroides）notabely，and increased short chain fatty acid content and reduced the pH of the fermentation broth as compared with the control group.The results showed that persimmon tannin could regulate the microflora in intestinal tract，which might be one of the mechanisms of persimmon tannin in vivo.

persimmon tannin；fermentation in vitro；gut microflora

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0160-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.025

2015－05－11

林款（1990-），女，碩士研究生，研究方向：柿單寧對腸道微生態(tài)的影響，E-mail：1027366570@qq.com。

*通訊作者：李春美（1973-），女，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學，E-mail：lichmyl@mail.hzau.edu.cn。

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201203047）；武漢市科技攻關計劃（20130205010186）。