Evofosfamide的合成工藝改進(jìn)*

姚 坤，陳冬寅，李 飛

(南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 211166)

氮芥類生物烷化劑是臨床廣泛使用的抗腫瘤藥物。環(huán)膦酰胺和異環(huán)膦酰胺等氮芥膦酰胺類前藥雖然能夠降低氮芥的毒副作用，但是其安全性仍然不能令人滿意［1］。重度乏氧是很多惡性腫瘤的特點(diǎn)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的耐受性、促使腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，是重要的不良預(yù)后因子［2－3］。

Evofosfamide［(1-甲基-2-硝基-1H-咪唑-5-基)甲基-N，N-二(2-溴乙基)磷酰(1)］是2012年由默克公司研發(fā)的用于治療晚期胰腺癌的藥物，它是氮芥膦酰胺類潛藥。在正常組織中，由于氧的濃度較高，該藥物的硝基不被還原，從而以毒性較小的潛藥狀態(tài)存在。在腫瘤組織中，由于氧濃度較低，吸電子的硝基被還原為供電子的氨基，使藥物不能穩(wěn)定存在而被代謝，釋放出強(qiáng)細(xì)胞毒性的氮芥類代謝產(chǎn)物，殺死腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，1在缺氧條件下的細(xì)胞毒性遠(yuǎn)高于在有氧的條件下的細(xì)胞毒性，最高相差1 000倍左右［4－5］。1在乏氧組織中具有高選擇性活性，它對(duì)遠(yuǎn)離血管的乏氧組織有非常好的殺傷力，而傳統(tǒng)的抗癌藥物如吉西他濱可以比較好地清除靠近血管的癌組織，因此，兩者聯(lián)合用藥抗癌效果更佳［6］。將1與培美曲塞聯(lián)合用藥用于治療晚期非鱗狀非小細(xì)胞肺癌，療效更佳［7］。人體中的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶1抑制劑 AZD7762S能夠增強(qiáng)1的藥效［8］。目前，1已獲得美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)行多項(xiàng)臨床試驗(yàn)，其中治療胰腺癌和晚期軟組織肉瘤已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，并獲得FDA批準(zhǔn)進(jìn)入快速通道［9］。

Scheme 1

2008年，Duan等［10］首次報(bào)道了1的合成路線。但文獻(xiàn)中只簡單介紹了關(guān)鍵中間體(3-甲基-2-硝基-3H-咪唑-4-基)甲醇(8)與氮芥類化合物(9)拼合制備1的方法。但8較為昂貴，迄今為止，其合成方法鮮有文獻(xiàn)［11］報(bào)道。該方法以N-甲酰肌氨酸甲酯(3)為原料，經(jīng)縮合、環(huán)合、氧化、水解和還原反應(yīng)等5步反應(yīng)制得8;8再與9拼合得1，總收率8%，且其中兩步反應(yīng)需柱層析分離，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。因此，對(duì)1的合成工藝進(jìn)行探索具有重要的意義。

為了建立1的有效合成方法，本文在文獻(xiàn)［11］方法的基礎(chǔ)上，以肌氨酸甲酯鹽酸鹽(2)為原料，與甲酸乙酯經(jīng)過甲?；涂s合兩步反應(yīng)制得鈉(E)-3-甲氧基-2-(N-甲?；?-3-氧代丙基-1-氨乙基-1-鹽(4);4在氰胺和乙酸鈉作用下環(huán)合得1-N-甲基-2-氨基咪唑-5-羧酸乙酯(5);5經(jīng)氧化得1-N-甲基-2-硝基咪唑-5-羧酸乙酯(6);6在堿性條件下水解、再還原羧基制得關(guān)鍵中間體8;8與9經(jīng)過Mitsunobu反應(yīng)合成了1(Scheme 1)，總收率16%，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR，13C NMR和HR-ESIMS確證。并對(duì)3，5和6的合成工藝進(jìn)行改進(jìn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-300型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Agilent-1100型質(zhì)譜儀。

薄層層析用GF254型硅膠，青島海洋化工廠生產(chǎn);其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1)3的合成

在反應(yīng)瓶中加入甲酸乙酯90 mL(1.11 mol)和乙醇80 mL，攪拌下依次加入2 20 g(0.14 mol)和碳酸鉀20 g，于35℃反應(yīng)2 h。抽濾，濾液減壓濃縮，干燥得淡黃色固體 3 15 g，產(chǎn)率 82%;1H NMR δ:8.62(s，1H)，4.68(s，2H)，3.68(s，3H)，3.47(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H9NO3{［M+H］+}131.057 7，found 131.058 2。

(2)5的合成

在反應(yīng)瓶中加入3 5 g(38.2 mmol)和甲酸乙酯16 mL(0.20 mol)，攪拌使其溶解;冷卻至0℃，分批加入 NaH 1.6 g(60%油狀混懸液，40 mmol)，加畢，于室溫反應(yīng)過夜。有黏稠物析出，用刮刀取出，置研缽中，加入己烷20 mL，研磨;不溶物用混合溶劑［EtOH(10 mL)+濃鹽酸(6 mL)］溶解，于110℃攪拌反應(yīng)1 h。冷卻至室溫，過濾，濾餅用乙醇洗滌。合并濾液和洗液，減壓濃縮得深棕色油狀物。加入混合溶液［NH2CN 3.5 g(83 mmol)+乙酸鈉9 g+10%HOAc 20 mL］中，于80℃反應(yīng)1 h。反應(yīng)混合物減壓濃縮至1/3，用20%碳酸鈉溶液調(diào)至pH≈9。用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得棕灰色固體，用丙酮重結(jié)晶得灰白色固體粉末5 4.8 g，產(chǎn)率 75%;1H NMR δ:7.62(s，1H)，4.20 ～4.10(m，2H)，3.52(s，3H)，1.53 ～1.50(m，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C7H11N3O2{［M －H］－}169.084 6，found 169.085 1。

(3)6的合成

在反應(yīng)瓶中加入亞硝酸鈉10 g(0.14 mol)和水30 mL，攪拌使其溶解;冰水浴冷卻，滴加5 3.7 g(21.9 mmol)的乙酸(20 mL)溶液，滴畢，于室溫反應(yīng)過夜。用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得微紅色固體，用丙酮重結(jié)晶得淡棕色固體6 2.8 g，產(chǎn)率65%;1H NMR δ:8.03(s，1H)，4.23 ～4.10(m，2H)，3.73(s，3H)，1.30 ～ 1.27(m，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C7H9N3O4{［M+H］+}199.058 8，found 199.059 3。

(4)7的合成

在反應(yīng)瓶中加入 6 3.9 g(19.6 mmol)，1 mol·L－1NaOH溶液60 mL和水20 mL，攪拌使其溶解;于室溫?cái)嚢柚寥芤鹤優(yōu)橥该鳒\棕色。用濃鹽酸調(diào)至pH 1，用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，用無水Na2SO4干燥。減壓濃縮得淡棕色固體7 3.2 g，產(chǎn)率 95%;1H NMR δ:11.50(br s，1H)，8.17(s，1H)，3.72(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H5N3O4{［M －H］－}171.027 5，found 171.028 0。

(5)8的合成

在反應(yīng)瓶中加入7 3.1 g(18.0mmol)和THF 36 mL，攪拌使其溶解;加入三乙胺14 mL，冰鹽浴冷卻，滴加氯甲酸異丁酯3.8 mL(28.8 mmol)，滴畢，反應(yīng)1 h。于0℃加入硼氫化鈉3.6 g，緩慢滴加水60 mL，滴畢(約需1 h)，有固體析出。過濾，濾餅用THF洗滌，合并濾液和洗液，減壓濃縮，殘余物用乙酸乙酯重結(jié)晶得橙色固體8 2.5 g，產(chǎn)率88%;1H NMR δ:7.44(s，1H)，4.63(s，2H)，3.72(s，3H);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C5H7N3O3{［M －H］－}157.048 2，found 157.048 7。

(6)1的合成

在反應(yīng)瓶中加入8 3.6 g(22.9 mol)和 THF 100 mL，攪拌使其溶解;依次加入三苯膦3 g，9 1.8 g(5.7 mmol)和二異丙基偶氮二羧酸酯(DIAD)2 mL，于室溫反應(yīng)2 h。減壓濃縮，殘余物經(jīng)快速硅膠柱層析［梯度洗脫劑:V(甲苯)∶V(丙酮)=3 ∶0 ～3 ∶7］純化得米白色固體1 4.9 g，產(chǎn)率 48%;1H NMR δ:7.23(s，1H)，5.04 ～ 5.12(m，2H)，4.95(d，J=7.60 Hz，2H)，3.94(s，3H)，3.42(t，J=7.24 Hz，4H)，3.01 ～ 3.17(m，4H);13C NMR δ:146.04，134.15(d，J=32.00 Hz)，126.20，55.60，42.74，34.36，34.11(d，J=17.40 Hz);HR-ESI-MS m/z:Calcd for C9H16N5O4PBr2{［M － H］－}446.930 2，found 446.930 7。

2 結(jié)果與討論

1的合成，文獻(xiàn)［11］方法以3為起始原料，經(jīng)6步反應(yīng)合成。該方法存在反應(yīng)操作繁瑣，總產(chǎn)率較低(6%)，合成過程中兩步反應(yīng)需硅膠柱色譜進(jìn)行分離純化等缺陷，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。本文采用價(jià)格較為便宜的2為起始原料的方法，經(jīng)7步反應(yīng)合成1。

在3的合成中，通過考察反應(yīng)溫度對(duì)收率的影響，得出35℃為最佳反應(yīng)溫度，使收率由76%(25℃)［11］提高至82%，反應(yīng)時(shí)間也縮短至2 h。

在5的合成中，將反應(yīng)溫度由95℃［11］降至80℃ ～85℃，減少了由于高溫所帶來的副產(chǎn)物，進(jìn)而提高了收率。

在6的合成中，首先采用了文獻(xiàn)［11］方法中的硅膠柱色譜分離法，但由于反應(yīng)本身不完全，且6與5極性差別較小，硅膠柱色譜分離造成產(chǎn)物損失，降低收率。為此，本文分別選用了乙醇、乙酸乙酯、甲苯和丙酮等溶劑重結(jié)晶的方法代替硅膠柱色譜分離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:經(jīng)丙酮重結(jié)晶的6，純度得到提升，且降低了實(shí)驗(yàn)的繁瑣程度。

經(jīng)過對(duì)3，5和6的工藝改進(jìn)，不僅總收率提高至16%，而且操作簡單，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)。

［1］Kumar D，Tewari-Singh N，Agarwal C，et al.Nitrogen mustard exposure of murine skin induces DNA damage，oxidative stress and activation of MAPK/Akt-AP1pathway leading to induction of inflammatory and proteolytic mediators［J］.Toxicology Letters，2015，235(3):161－171.

［2］劉小艷，許新華.乏氧微環(huán)境與腫瘤治療抗拒［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2013，34(23):3667 －3669.

［3］Gilkes D M，Semenza G L，Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:Drivers of tumour metastasis［J］.Nat Rev Cancer，2014，14(6):430 －439.

［4］Yeh J J，Kim W Y.Targeting tumor hypoxia with hypoxia-activated prodrugs［J］.Journal of Clinical Oncology，2015，33(13):1505 －1508.

［5］Liu Q，Sun J D，Wang J，et al.TH-302，a hypoxiaactivated prodrug with broad in vivo preclinical combination therapy efficacy:Optimization of dosing regimens and schedules［J］.Cancer Chemotherapy and Pharmacology，2012，69(6):1487 －1498.

［6］Borad M J，Reddy S G，Bahary N，et al.Ranomized phase II trial of gemcitabine plus TH-302 versus gemcitabine in patients with advanced pancreatic cancer［J］.Journal of Clinical Oncology，2015，33(13):1475 －1482.

［7］Goldman J，Belani C，Novello S，et al.Randomized，double-blind，placebo-controlled trial of evofosfamide(TH-302)in combination with pemetrexed in advanced non-squamous non-small cell lung cancer［J］.Annals of Oncology，2015，26(Suppl 1):29 －44.

［8］Sun J D，Meng F Y，Liu Q，et al.Association between Chk1 inhibitor AZD7762-mediated modulation of pharmacodynamic biomarkers and potentiation of hypoxia-activated prodrug evofosfamide(TH-302)antitumor efficacy in a human tumor xenograft model［M］.San Francisco，American Association for Cancer Research，2015.

［9］http://www.fiercebiotech.com/tags/threshold-pharmaceuticals.

［10］Duan J，Jiao H，Kaierman J，et al.Potent and highly selective hypoxia-activated achiral phosphoramidate mustards as anticancer drugs［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2008，51(8):2412 －2420.

［11］Matteucci M，Duan J，Jiao H，et al.氨基磷酸酯烷化劑前體藥物［P］.CN 200 680 030 082.8，2009.