青海地區(qū)馬鈴薯表面附著乳酸菌多樣性的研究

張志霞，施環(huán)宇，孫巖巖，談重芳，張 淼，崔美巖，王雁萍，李宗偉

（鄭州大學(xué) 河南省離子束生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001）

0 引言

馬鈴薯是茄科屬多年生塊莖草本植物，具有產(chǎn)量高、生育期短、營養(yǎng)豐富、消化率高等特性[1].馬鈴薯的莖葉柔嫩且多汁，具有較好的飼料應(yīng)用潛質(zhì)，在我國青藏高原地區(qū)有廣泛的種植基礎(chǔ).

乳酸菌（LAB,lactic acid bacteria）不是分類學(xué)上的名詞，而是指一群可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的總稱[2].這類細(xì)菌在自然界分布極為廣泛，具有明顯的物種多樣性.近年來對青藏高原地區(qū)乳酸菌的研究大部分為乳制品方面的[3-5]，相對比植物自然附著的乳酸菌的研究少，因此需要對植物附著乳酸菌的多樣性進(jìn)行進(jìn)一步的研究.

作者以青海部分地區(qū)馬鈴薯植株為對象，分離鑒定了其表面附著的乳酸菌，并分析了不同來源樣品中乳酸菌在數(shù)量和種類上的差異.一方面評估青海地區(qū)馬鈴薯自然附著乳酸菌的多樣性，豐富乳酸菌菌種；另一方面為食品和飼料發(fā)酵提供乳酸菌菌種資源.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集及處理

2012 年9 月從中國青藏高原青海省部分地區(qū)采集馬鈴薯植株及其根系土壤，樣品采集地與分離到的乳酸菌株見表1.為了分析樣品莖葉和根附生乳酸菌的差異，每個(gè)樣品的莖葉和根被視為不同樣品種類.所有樣品均由無菌剪刀剪碎，然后各取10 g 加入裝有90 mL 滅菌水的錐形瓶中，在漩渦振蕩器上振蕩均勻后，稀釋5 個(gè)梯度，然后各取20 μL 10-1、10-3和10-5倍樣品稀釋液分別涂布在MRS 培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h.進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并且根據(jù)菌落大小、形態(tài)和顏色等特征，挑取單菌落在MRS 培養(yǎng)基上劃線純化兩次，-80 ℃下保存在10%二甲基亞砜的NB 培養(yǎng)基中備用[6].

1.1.2 主要試劑和儀器

培養(yǎng)基：MRS 肉湯培養(yǎng)基（Difco Laboratories,Detroit，MI，USA）；Nutrient Agar 培養(yǎng)基（Nissui Ltd.，Tokyo，Japan）；Agar(Nissui Ltd.，Tokyo，Japan）.以上培養(yǎng)基pH 均為6.5～7.0，固體培養(yǎng)基瓊脂粉加入量為1.5%.

PCR 擴(kuò)增儀（Thermo Arktik）：美國賽 默飛；Bio -Rad GelDocTMXR 凝膠成像儀、Bio -Rad PoweePac Basic 電泳儀：美國伯樂.

表1 馬鈴薯表面附著乳酸菌分布情況Table 1 The diversity of lactic acid bacteria associated with potato

1.2 菌株生理生化特征測定

1.2.1 形態(tài)特征

包括單菌落的形狀、大小、光澤、顏色、突起等一些表面特征，同時(shí)通過顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)特征.

1.2.2 生理生化特征

菌株檢測的生理特征主要有耐鹽（NaCl）濃度、pH 范圍生長、溫度范圍生長試驗(yàn)，使用紫外分光光度計(jì)測定其生長狀況值.耐鹽濃度試驗(yàn)測定：在含有3.0%和6.5%（W/V）NaCl 的液體MRS 培養(yǎng)基（pH 6.5）中分別接種菌株，放置于普通恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃）中培養(yǎng)48 h，對照組為0%NaCl.pH 范圍生長試驗(yàn)測定：分別在pH 為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、9.0、10.0 的MRS 液體培養(yǎng)基中接種單菌落，放置于普通恒溫培養(yǎng)箱（30 ℃）中培養(yǎng)7 d與對照組（pH 6.5）相比.溫度范圍生長試驗(yàn)測定：在液體MRS 培養(yǎng)基（pH 6.5）中接種菌株，分別放置于5、10、45、50 ℃下培養(yǎng)，其中45 ℃和50 ℃下培養(yǎng)7 d，5 ℃和10 ℃培養(yǎng)14 d，對照管為30 ℃（7 d）.

菌株測試的生化特征主要包括：過氧化氫酶試驗(yàn)、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)（同型或異型發(fā)酵試驗(yàn)）、碳源發(fā)酵試驗(yàn)等，具體試驗(yàn)方法見參考文獻(xiàn)[7].

1.3 菌株P(guān)CR 擴(kuò)增

采用菌落PCR 法，擴(kuò)增16sRNA 的部分基因.使用固體純化法培養(yǎng)出實(shí)驗(yàn)菌株單菌落后，挑取單菌落加入PCR 反應(yīng)體系中.PCR 反應(yīng)體系為50 μL：Premix Taq 25 μL，正向和反向引物（均為20 μmol·L-1）1 μL，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL，16 sRNA片段的擴(kuò)增引物為通用引物 27F (5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT -3’).反應(yīng)條件為94 ℃30 s、55 ℃30 s 以及72 ℃90 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃10 min.以不加單菌落的體系做陰性對照，1%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果.

將無法用菌落PCR 擴(kuò)增出條帶的菌株用細(xì)菌全基因組提取試劑盒提取其DNA 后再進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為50 μL：Premix Taq 25 μL，DNA模板5 μL，27 F 和1 492 R（均為20 μmol·L-1）1 μL，補(bǔ)充雙蒸水至50 μL，反應(yīng)條件與菌落PCR 條件一致，電泳檢測條件也一樣.

1.4 16S rDNA 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

將菌落PCR 和DNA 提取后的PCR 產(chǎn)物送到華大基因公司測序，將測序所得1 500 bp 左右的16S rDNA 序列在GeneBank 中使用程序Blast 尋找與其最大同源性的的序列.如果測序菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株間的16S rDNA 同源性值在97.5% 以上，一般就可判定它們屬于同一個(gè)種.將測序所得的序列和Blast 所得的標(biāo)準(zhǔn)序列導(dǎo)入CLUSTAL W 軟件進(jìn)行比對后，用MEGA5.0 軟件中的鄰接法（neighborjoining method）構(gòu)建進(jìn)化樹[8].進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)采用序列數(shù)據(jù)的步長分析法進(jìn)行1 000 次隨機(jī)采樣估算[9]，并且將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis NCDO 1769T 作為外圍菌株.

2 結(jié)果和分析

2.1 馬鈴薯表面自然附著的乳酸菌的分布狀況

從青海省10 個(gè)不同地點(diǎn)采集了10 份馬鈴薯樣品，并對每份樣品的莖葉和根部分開處理.如表1 所示，從巴燕鎮(zhèn)采集到的9-23-7 號樣品莖葉中沒有分離出乳酸菌，而其根系土壤中檢測到的乳酸菌，其數(shù)量為104CFU/g，而采集自互助縣的9-25-3 號樣品卻是只在莖葉中分離到了乳酸菌，數(shù)量為105CFU/g，其余8 個(gè)地點(diǎn)采集到的馬鈴薯樣品莖葉處理和根部處理均分離出乳酸菌.其中9-26-10、9-23-2、9-24-6 號樣品分離到了較多形態(tài)學(xué)上不同的乳酸菌，整體上根部分離到的乳酸菌類型相對多于莖葉.10 份樣品都成功分離到了乳酸菌，可以看出青海部分地區(qū)馬鈴薯自然附著的菌株廣泛存在乳酸菌.

2.2 馬鈴薯樣品中乳酸菌的生理生化性狀

馬鈴薯樣品中乳酸菌代表菌株生理生化特征如表2 所示，所有的代表菌株都是革蘭氏反應(yīng)陽性、過氧化酶反應(yīng)陰性的球菌，根據(jù)分離到的乳酸菌形態(tài)學(xué)特征和生理生化特征及鑒定結(jié)果將馬鈴薯樣品中乳酸菌分為5 組（PA-PE），表中的菌株為每個(gè)分組的代表菌株.PA 組乳酸菌包含菌株qz-543、qz-771、qz-770、qz-772、qz-279、qz-280、qz-768、qz-594、qz-769、qz-278、qz-695、qz-275x、qz-274、qz-544、qz-568、qz-545、qz-569、qz-570、qz-275d、qz-349、qz-658、qz-698 和qz-700，PB 組包含乳酸菌菌株qz-277、qz-346 和qz-660，PC 組包含乳酸菌菌株qz-596、qz-593、qz-655、qz-571 和qz-242，PD 組包含乳酸菌菌株qz-598、qz-766、qz-602、qz-301、qz-657 和qz-767，PE 組包含乳酸菌菌株qz-240、qz-239、qz-603、qz-348、qz-347、qz-241 和qz-661.

表2 馬鈴薯代表菌株生理生化特征Table 2 Characteristics of lactic acid bacteria strains isolated from the samples of potat

如表2 所示，PA 組的代表菌株在pH 值9 和10 的表現(xiàn)為不能生長或生長較弱，在溫度50 ℃時(shí)生長微弱，而在試驗(yàn)的兩個(gè)NaCl 濃度、pH 值3～8以及溫度5、10、45 ℃條件下生長良好.由于PA 組包含較多菌株，不同菌株間會(huì)存在一定的差異，表2 只顯示了PA 組代表菌株的生理生化特征.PB 組乳酸菌代表菌株能夠在5、10、45、50 ℃，3.0%NaCl和pH 值4～9 的條件下生長良好，而在相對高濃度的NaCl 及高pH（10）條件下不能生長，在pH 3.5及以下時(shí)生長較弱.PC 組乳酸菌代表菌株10 ℃、3.0%NaCl、pH 值3～9 之間生長良好，5、45、50 ℃；6.5%NaCl 的條件下生長微弱，pH 值10 時(shí)不能生長.PD 組乳酸菌代表菌株整體表現(xiàn)良好，只有在50 ℃表現(xiàn)較弱.PE 組乳酸菌代表菌株在50 ℃、pH值3～4.5 條件下生長微弱，在5、10、45 ℃，3.0%和6.5%NaCl、pH 值5～10 的條件下生長良好.

PA 組和PB 組乳酸菌代表菌株能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，為異型發(fā)酵菌株，而PC 組、PD 組和PE 組不能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，是同型發(fā)酵菌株.

2.3 馬鈴薯樣品中乳酸菌代表菌株碳源發(fā)酵特性

馬鈴薯樣品中所分離乳酸菌代表菌株的碳源發(fā)酵特性如表3 所示，所有的菌株都不能發(fā)酵利用赤蘚糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、核糖醇、β-甲基木糖苷、山梨糖、半乳糖醇、纖維糖、菊糖、木糖醇、D-來蘇糖、D-海藻糖、L-海藻糖和L-阿拉伯醇作為碳源；所有的菌株都能發(fā)酵利用葡萄糖作為碳源.

表3 馬鈴薯樣品中乳酸菌代表菌株碳源發(fā)酵Table 3 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strainsisolsted from the samples of potatoa

2.4 馬鈴薯樣品中乳酸菌代表菌株16S rRNA 基因序列分析

由馬鈴薯樣品分離到的乳酸菌代表菌株16 S rRNA 系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1 所示，利用16S rRNA 基因序列blast 結(jié)果和系統(tǒng)進(jìn)化樹圖分析，PA 組和PB 組乳酸菌被鑒定到Leuconostoc 屬，并且PA 組鑒定為Ln.mesenteroides 種，系統(tǒng)進(jìn)化樹并不能把PA 組鑒定到亞種水平，需進(jìn)一步探討.結(jié)合Masanori 等[10]研究結(jié)果分析，如表3 所示，乳酸菌菌qz-569、qz-570 和qz-275 不能夠利用阿拉伯糖和纖維二糖碳源發(fā)酵，能夠利用蔗糖和海藻糖發(fā)酵，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Ln.mesenteroides subsp.dextranicum JCM 9700T一致，可以將這4 株菌株鑒定為Ln.mesenteroides subsp.dextranicum，而乳酸菌菌株qz-594 和qz-279 能夠利用阿拉伯糖、纖維二糖、蔗糖和海藻糖碳源發(fā)酵，與標(biāo)準(zhǔn)菌株Ln.mesenteroides subsp.mesenteroides JCM 6124T一致，所以可以將這2 株菌鑒定到Ln.mesenteroides subsp.mesenteroides.而PB 組代表菌株卻能夠直接鑒定到Ln.lactis，并且qz-277 的blast 結(jié)果為99%而qz-346 和Ln.lactis 的同源性是100%.PC 組乳酸菌代表菌株認(rèn)定為Lactococcus 屬，系統(tǒng)進(jìn)化樹能夠?qū)C 組乳酸菌菌株鑒定到L.lactis，卻不能將PC 組菌株鑒定到亞種的水平.依據(jù)Masanori 的研究工作，如表3 所示，乳酸菌菌株qz-596 和qz-242 均能利用乳糖、半乳糖、麥芽糖和核糖碳源發(fā)酵，與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.lactis subsp.lactis JCM 5805T一致，因此，可以將乳酸菌菌株qz-596 和qz-242 鑒定為L.lactis subsp.lactis，乳酸菌菌株qz-655 不能利用乳糖、半乳糖、麥芽糖和核糖碳源發(fā)酵，與標(biāo)準(zhǔn)菌株L.lactis subsp.hordniae JCM 1180T一致，所以能夠?qū)⑷樗峋阸z-655 鑒定成L.lactis subsp.hordniae.從進(jìn)化樹上可以看出PD 組和PE組乳酸菌屬于Enterococcus 屬，其中PD 組乳酸菌可以確定為E.mundtii，bootstrap 值達(dá)到100%，而PE 組乳酸菌定位到E.gallinarum，且blast 顯示的序列同源性都在99%以上.

圖1 馬鈴薯樣品分離乳酸菌16S 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationship between the 16S rRNA gene sequences of strains

3 討論

從青海部分地區(qū)馬鈴薯表面附著的乳酸菌分布（表1）來看，不同地區(qū)采集到的新鮮馬鈴薯樣品大部分都存在乳酸菌，其數(shù)量介于6.5×103到3.2×108CFU/g），只有兩份處理組沒有檢測到有乳酸菌的存在.分離到的乳酸菌被歸為3 個(gè)屬，分別為Leuconostoc（60%）、Lactococcus（14.3）和Enterococcus（25.7%），分屬于7 個(gè)種或者亞種分別為Ln.mesenteroides subsp.dextranicum、Ln.mesen-teroides subsp.mesenteroides、Ln.lactis、L.lactis subsp.lactis、L.lactis subsp.hordniae、E.mundtii 和E.gallinarum.對比來說，明串珠菌一般多存在于乳制品中，而在植物中較少發(fā)現(xiàn)，與西藏地區(qū)藏蒿草附著乳酸菌比較[12]，其分離到的乳酸菌鑒定為2 個(gè)屬3 個(gè)種，分別為Ln.mesenteroides subsp.mesenter-oides、W.cibaria 和W.confuse，而本研究中青海部分地區(qū)的馬鈴薯附生的乳酸菌菌種相對更豐富.目前大多數(shù)研究中，乳酸菌的多樣性研究多集中于乳制品和發(fā)酵產(chǎn)品，對植物表面自然附著乳酸菌的研究較少，本研究為進(jìn)一步發(fā)掘青藏高原地區(qū)的乳酸菌資源具有積極意義.

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