極端低溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響

張會(huì)娜，呂建華，白旭光，劉淑麗

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

昆蟲屬于變溫動(dòng)物，溫度幾乎影響昆蟲生長發(fā)育及生存的各個(gè)方面.溫度可直接作用于昆蟲酶活性并影響昆蟲的行為與健康，是重要的環(huán)境因素之一[1].低溫能導(dǎo)致昆蟲體內(nèi)氧負(fù)離子（O2-）、單線態(tài)氧（1O2）等活性氧自由基增加，造成細(xì)胞膜脂的過氧化損傷.低溫脅迫下，昆蟲能利用生理調(diào)整策略來適應(yīng)環(huán)境，其中包括酶代謝水平的改變、防凍保護(hù)劑的合成等[2].超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）是廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶，能相互協(xié)調(diào)清除活性氧，起到防止自由基毒害的積極作用，被稱為保護(hù)酶系統(tǒng)[3].SOD 能催化超氧陰離子自由基（O2·-）發(fā) 生 歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，具有特殊的生理活性，是生物體內(nèi)清除自由基的重要保護(hù)酶.CAT 和POD 存在于過氧化物酶體中，具有分解H2O2的作用，使得H2O2不致于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成有害的—OH，是生物抗氧化防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶[4].因此，極端低溫條件下保護(hù)酶活性水平可作為衡量昆蟲抗寒性強(qiáng)弱的重要指標(biāo).作者以重要儲(chǔ)糧害蟲玉米象Sitophilus zeamais 成蟲為研究對(duì)象，探究極端低溫條件下玉米象保護(hù)酶活性的變化，為揭示昆蟲對(duì)低溫的適應(yīng)機(jī)制、有效進(jìn)行低溫殺蟲、科學(xué)實(shí)施低溫儲(chǔ)糧提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx為河南工業(yè)大學(xué)儲(chǔ)藏物昆蟲實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)數(shù)代的玉米象，在（28±1）℃、RH（75±5）% 的條件下以整粒干凈的小麥飼養(yǎng)，取羽化后1～2 周的健康成蟲供試.

1.2 低溫處理方法

在洗凈、烘干的玻璃瓶（直徑4 cm，高9.5 cm）內(nèi)部瓶口處涂上聚四氟乙烯（防止試蟲逃逸），再烘干并冷卻至室溫，放入20 頭羽化1～2 周的玉米象成蟲（不分雌雄）.設(shè)置高低溫試驗(yàn)箱溫度分別為-8、-12、-16、-20 ℃4 個(gè)溫度梯度，達(dá)到設(shè)定溫度并穩(wěn)定后快速放入裝有試蟲的玻璃瓶，處理一定的時(shí)間后快速取出，重復(fù)3 次，在液氮中研磨制備酶液.不同低溫下不同處理時(shí)間設(shè)定見表1.

表1 玉米象成蟲的處理溫度和時(shí)間設(shè)置Table 1 Exposure time for S.zeamais adults at different treatment temperatures

1.3 酶活性測(cè)定

1.3.1 酶液的制備

參照李周直等[4]的方法并加以改進(jìn).取經(jīng)過低溫處理的玉米象成蟲20 頭，用pH 7.2 的Tris-HCl緩沖液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）清洗干凈，液氮研磨，將研磨液轉(zhuǎn)入2.0 mL 預(yù)冷的離心管中，用Tris-HCl 緩沖液沖洗研缽后并入研磨液中，用緩沖液補(bǔ)充至2.0 mL，于0～4 ℃以11 000 r/min 離心20 min，取上清液作為提取酶液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中.

1.3.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

參照Bradford[5]的標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定上述酶液中蛋白質(zhì)含量（mg/mL）.

1.3.3 酶活性測(cè)定

超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.15.1.1）活性的測(cè)定參考馬志卿等[6]的鄰苯三酚法.調(diào)整H2O、鄰苯三酚的比例，保證鄰苯三酚的自氧化速率為0.70，加入pH 為8.2 的0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液（含1%聚乙烯吡咯烷酮和1% EDTA），SOD 活性計(jì)算公式為：

式中：OD1為鄰苯三酚2 min 吸光度，OD2為樣品所測(cè)吸光度；試蟲蛋白質(zhì)含量，mg.一個(gè)酶活單位(U)相當(dāng)于4.525 mL 反應(yīng)液達(dá)到50%的抑制所需的酶量，酶活性以U/mg 表示.

過氧化物酶（POD，EC 1.11.1.7）活性的測(cè)定參考Simon 等[7]的愈創(chuàng)木酚法.反應(yīng)混合液為2.0 mL pH 為4.0 的醋酸緩沖液、50 μL 酶液、1.0 mL 0.05 mol/L 愈創(chuàng)木酚、1.0 mL 0.3 mol/L 的H2O2，加入試管立即搖勻并迅速倒入比色皿中，于470 nm 波長下比色，以蒸餾水調(diào)零，以緩沖液代替酶液作對(duì)照，記錄4 min 后的吸光度值.以每分鐘吸光度改變1為一個(gè)酶活單位(U)，POD 活性計(jì)算公式為：

式中：OD1為混合液470 nm 的吸光度，t 為反應(yīng)時(shí)間.

過氧化氫酶（CAT，EC 1.11.1.6）活性的測(cè)定參考楊蘭芳等[8]的標(biāo)準(zhǔn)曲線法.取A、B 兩支試管，A為對(duì)照管，B 為樣品管.在A 中按順序加入1.5 mL pH 7.8 Tris-HCl 緩沖溶液（內(nèi)含1%的聚乙烯吡咯烷酮和1%的EDTA）、0.1 mL 酶液、1.4 mL H2O、1.0 mL 8% H2SO4；B 管依次加入1.5 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.1 mL 酶液、1.1 mL H2O、0.3 mL 0.3 mol/L 的H2O2，搖勻，反應(yīng)3 min 后加入1.0 mL 8%H2SO4終止反應(yīng).用A 管調(diào)零，在波長為240 nm 處測(cè)定樣品管的吸光度，酶活性計(jì)算公式為：

式中：A2為對(duì)照的吸光度，A1為樣品的吸光度，t 為反應(yīng)時(shí)間（min），a、b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程中的常數(shù).

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對(duì)所取得的數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、SAS 9.0 軟件進(jìn)行方差分析，采用Duncan′s 新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的可信度以及不同處理結(jié)果的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 吸光度與蛋白質(zhì)、過氧化氫含量的關(guān)系

對(duì)不同含量的蛋白質(zhì)、過氧化氫所對(duì)應(yīng)的吸光度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖1、圖2 所示.由圖1、圖2 可知，蛋白質(zhì)和H2O2含量都與吸光度呈顯著的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.997 9，因此，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行蛋白質(zhì)和H2O2定量分析是可行的.

圖1 吸光度與蛋白質(zhì)含量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of absorbance value and protein content

圖2 吸光度與H2O2 含量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of absorbance value and H2O2 content

2.2 低溫對(duì)玉米象成蟲保護(hù)酶活性的影響

2.2.1 -8 ℃低溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響

玉米象成蟲經(jīng)-8 ℃低溫處理不同時(shí)間后其SOD 活性整體呈現(xiàn)先升高后降低再升高的趨勢(shì)，POD 和CAT 活性則隨著處理時(shí)間的延長先升高后降低（表2）.短時(shí)低溫處理對(duì)試蟲酶活性起到激活作用.由表2 可知，在低溫處理時(shí)間為60 min 時(shí)，3 種保護(hù)酶活性都出現(xiàn)最大值，顯著高于對(duì)照組水平（P＜0.05），之后則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，酶活性受到抑制.SOD 在處理時(shí)間為180 min 時(shí)活性達(dá)到最低值6.32 U/mg，為對(duì)照組的85.9%，表現(xiàn)為抑制作用.POD 和CAT 在處理時(shí)間為480 min 時(shí)活性最低，與最大值相比，降幅分別為38.5%和59.1%，延長低溫處理時(shí)間能抑制保護(hù)酶的活性.

2.2.2 -12 ℃低溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響（表3）

從表3 可以看出，在-12 ℃低溫處理?xiàng)l件下，隨著處理時(shí)間延長，試蟲體內(nèi)SOD、POD、CAT 活性都是先升高后降低.在處理時(shí)間為40～110 min 之間，SOD 活性降幅達(dá)到51.6%，活性被逐漸抑制，經(jīng)方差分析，不同處理時(shí)間活性差異達(dá)到顯著水平（F=11.503，df=8，P=0.000）.POD 活性在低溫處理時(shí)間為110 min 時(shí)顯著低于對(duì)照組，其他低溫處理時(shí)間活性水平則跟對(duì)照組無顯著性差異（P ＞0.05），表明低溫處理時(shí)間延長到一定程度時(shí)對(duì)POD 的抑制作用較明顯.CAT 在低溫處理時(shí)間為60、70 min 時(shí)活性高于對(duì)照組，分別是對(duì)照組的1.64 和1.66 倍，活性被激活，其他時(shí)間段活性與對(duì)照組無顯著性差異（P＞0.05）.

表2 -8 ℃低溫處理不同時(shí)間后玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性變化Table 2 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -8 ℃low temperature

表3 -12 ℃低溫處理不同時(shí)間后玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性變化Table 3 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -12 ℃low temperature

2.2.3 -16 ℃低溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響

經(jīng)-16 ℃低溫處理不同時(shí)間后，玉米象體內(nèi)3種保護(hù)酶活性變化趨勢(shì)與-12 ℃處理類似，3 種保護(hù)酶活性出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象（表4）.低溫處理時(shí)間由25 min 延長到60 min 時(shí)，SOD 活性由13.18 U/mg 逐漸降低至7.24 U/mg，活性被抑制.POD 和CAT 活性在處理時(shí)間為40 min 時(shí)達(dá)到峰值，顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）.整個(gè)處理過程中，POD 和CAT 活性整體較高，在低溫處理時(shí)間達(dá)到60 min 時(shí)活性出現(xiàn)最低值.

2.2.4 -20 ℃低溫處理對(duì)玉米象保護(hù)酶活性的影響（表5）

由表5 可知，在-20 ℃低溫處理時(shí)玉米象成蟲SOD 活性變化趨勢(shì)與-12 ℃、-16 ℃處理時(shí)相同，都是隨著處理時(shí)間的延長先升高后降低.POD、CAT 活性隨著處理時(shí)間延長逐漸降低，活性被抑制.3 種保護(hù)酶峰值都出現(xiàn)在處理13 min 時(shí)，當(dāng)?shù)蜏靥幚頃r(shí)間延長到30 min 時(shí)，與最大值相比，SOD、POD、CAT 活性分別降低了8.46 U/mg、0.11 U/mg、2.69 mg/（mg·min），差異達(dá)到顯著水平（P＜0.05），表明延長低溫處理時(shí)間能導(dǎo)致保護(hù)酶代謝水平減弱.

表4 -16 ℃低溫處理不同時(shí)間后玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性變化Table 4 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -16 ℃low temperature

3 結(jié)論

昆蟲體內(nèi)酶代謝水平與環(huán)境溫度密切相關(guān).本文研究結(jié)果表明，玉米象體內(nèi)的保護(hù)酶代謝水平受溫度和處理時(shí)間的影響，溫度越低，酶活性下降越快.在-8 ℃低溫下處理玉米象480 min 后，其SOD 活性仍高于對(duì)照水平，表明亞致死低溫脅迫能導(dǎo)致SOD 活性提高，使自由基的清除能力增強(qiáng)，POD 和CAT 活性則低于對(duì)照組，表明活性受抑制，可能影響3 種酶的協(xié)調(diào)作用.短時(shí)間的極端低溫處理后，保護(hù)酶活性出現(xiàn)應(yīng)激性升高現(xiàn)象，對(duì)試蟲免受自由基損傷和增強(qiáng)耐低溫性起重要作用，但保護(hù)酶的調(diào)節(jié)作用有限，持續(xù)延長低溫處理時(shí)間能導(dǎo)致保護(hù)酶代謝水平下降，影響昆蟲正常的生理功能[9-10].

表5 -20 ℃低溫處理不同時(shí)間后玉米象體內(nèi)保護(hù)酶活性變化Table 5 Changes of the activity of protective enzymes in S.zeamais after different treatment time at -20 ℃low temperature

SOD 催化O2·-發(fā)生歧化反應(yīng)（O2·-+O2·-+2H+→O2+H2O2）是昆蟲低溫抗氧化防御系統(tǒng)的主要過程，在防止蛋白質(zhì)、膜脂等細(xì)胞的過氧化損傷方面起重要作用[11-12].本文研究結(jié)果表明，在不同程度的低溫處理下，玉米象體內(nèi)SOD 活性在低溫處理初期較高，表明昆蟲在受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)活性氧自由基能在短時(shí)間內(nèi)增加，導(dǎo)致SOD 催化超氧陰離子自由基能力變強(qiáng)，相應(yīng)增強(qiáng)昆蟲的耐低溫能力.但由于SOD 顯示出不同的特性和細(xì)胞間的定位，不能排除在極端低溫條件下一些SOD 同工酶活性是不斷變化的[13].CAT 能將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O 和O2，POD 則通過酚類化合物和抗氧化劑共基質(zhì)的氧化分解H2O2，與CAT 共同作用清除H2O2[14].在本研究中，玉米象體內(nèi)POD 和CAT 活性一般在低溫處理中期達(dá)到峰值，相對(duì)SOD 有一定的滯后效應(yīng)，可能是由于CAT 對(duì)H2O2親和力較低，或者因?yàn)镃AT 是局部的過氧化物酶體，在H2O2濃度低于一定閾值時(shí)不催化反應(yīng)[15].由此表明玉米象體內(nèi)3 種保護(hù)酶在抵御極端低溫脅迫方面具有協(xié)同作用.昆蟲在受到低溫脅迫時(shí)，體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基增加，抗氧化體系能迅速啟動(dòng)體內(nèi)防御系統(tǒng)，使SOD 催化O2·-歧化反應(yīng)生成H2O2，H2O2濃度上升引起POD 和CAT 活性的增強(qiáng)，隨著處理時(shí)間的延長，3 種保護(hù)酶活性降低，可能導(dǎo)致細(xì)胞受到氧化損傷.

極端低溫能改變昆蟲體內(nèi)保護(hù)酶的代謝水平，其變化情況受低溫程度和低溫持續(xù)時(shí)間的影響.值得注意的是，僅對(duì)保護(hù)酶活性變化進(jìn)行分析并不能完全解釋昆蟲抗氧化機(jī)理，在極端低溫脅迫下昆蟲的保護(hù)機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，包括一些抗氧化分子的產(chǎn)生和其他酶類的變化，它們對(duì)昆蟲的生理生化調(diào)控作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究[16-17].

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