低溫鍛煉對釀酒酵母發(fā)酵特性的影響

吳蘇生，白 亮，鄭祖亮，張玲玲，劉 晴，趙 輝，杜 剛*

（天津商業(yè)大學 生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134）

低溫發(fā)酵（10～15 ℃）可以減少高級醇含量以及增加萜烯類和乙酸酯類香氣物質(zhì)[1-2]，從而提高葡萄酒的風味[3-4]，因此低溫發(fā)酵技術被廣泛的應用于葡萄酒的生產(chǎn)中。例如，白葡萄酒和桃紅葡萄酒的發(fā)酵溫度為10～15 ℃，冰酒和起泡葡萄酒的瓶內(nèi)二次發(fā)酵溫度為8 ℃左右。然而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的最適發(fā)酵溫度為25～28 ℃，低溫發(fā)酵不僅降低酵母細胞的生長速率，延長潛伏期至一周以上，而且降低發(fā)酵速率，使發(fā)酵周期延長至兩周以上，給葡萄酒產(chǎn)業(yè)帶來巨大損失[5]。因此，選育具有優(yōu)良發(fā)酵性能的低溫釀酒酵母對葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關重要。

為了保持葡萄酒酵母代謝研究中發(fā)酵培養(yǎng)基成分的一致性，模擬合成葡萄汁培養(yǎng)基被廣泛應用到實驗室的研究中[6]。在實際操作中，活性干酵母的活化溫度為40 ℃左右，而發(fā)酵溫度為10～15 ℃，若直接把活化好的酵母接種到發(fā)酵罐內(nèi)，會對酵母的存活率和發(fā)酵的啟動產(chǎn)生不良影響，使發(fā)酵啟動點推遲。為了使酵母適應這種低溫的發(fā)酵環(huán)境，實際操作中，先將活化好的酵母與葡萄汁混合，再控制溫度逐漸下降至發(fā)酵溫度，目的是使釀酒酵母適應低溫的發(fā)酵環(huán)境后再啟動發(fā)酵。但此低溫鍛煉操作缺乏科學性解釋并且相關的低溫鍛煉的研究較少且不夠深入，因此，該文開展與低溫鍛煉相關的研究，不僅可以用于解釋上述干酵母活化實際操作的科學性，而且對低溫鍛煉的研究內(nèi)容提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霞多麗葡萄：采摘于北京郊區(qū)的葡萄園。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BH8：從中科院植物所選育的釀酒品種“北紅”中篩選得到并由中科院微生物研究所鑒定[7]。

硫代硫酸鈉、硫酸銨、酒石酸、亞甲基藍、檸檬酸鈉、濃硫酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀、無水乙醇等均為分析純：北京藍弋化工產(chǎn)品有限責任公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏：淮坊盛泰藥業(yè)有限公司；二烷酸二甲酯（dimethyl dicarbonate）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-（2-hydroxyerhyl）piperazine-1-erhaesulfonic acid，hepes）緩沖液、磷酸二羥基丙酮（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）、尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、乙二胺四乙酸（ethlenediaminetetra acetic acid，EDTA）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）：美國Sigma公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖2.0%，酵母膏2.0%，蛋白胨2.0%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min[8]。

1.2 儀器與設備

Waters2695高效液相色譜儀、Waters2414示差檢測器、Aminex HPX-87H色譜柱：美國伯樂公司；Q700超聲破碎儀：寧波天生科技有限公司；0.22 μm纖維素膜：廣州市荔灣區(qū)精科玻璃儀器貿(mào)易商行；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；MPR-1411R-PC大容量環(huán)境試驗箱：北京西沖科技發(fā)展有限公司；TGL-16型高速臺式離心機：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；WP-1型紫外分析儀：溫州永嘉上塘教學儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 低溫鍛煉

釀酒酵母BH8在YPD培養(yǎng)基中25 ℃培養(yǎng)12 h，然后每隔10 min控制溫度下降1 ℃，直到溫度降至13 ℃。以未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母為對照，把未經(jīng)鍛煉的釀酒酵母稱為B，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母稱為B1。

1.3.2 低溫發(fā)酵試驗

霞多麗葡萄經(jīng)壓榨后，在10 ℃澄清18 h，然后分離出清汁并添加20 mg/L二氧化硫，含糖量調(diào)至200 g/L。利用硫酸銨將含氮量調(diào)至190 mg/L[9]，因酒石酸在葡萄和葡萄酒中均有存在，并且不容易被酵母菌代謝，故利用85%的酒石酸將葡萄汁的pH值調(diào)為3.3。最后添加體積分數(shù)為0.2%的二烷酸二甲酯，將葡萄汁于4 ℃靜置48 h，消除微生物的污染[10]。

發(fā)酵液裝液量為400 mL/500 mL，頂部連有發(fā)酵栓，其可使酵母代謝產(chǎn)物二氧化碳排出和發(fā)酵過程中對發(fā)酵液的取樣，同時又阻止了外部氧氣的進入。起始加入的釀酒酵母約為1×106個/mL。低溫發(fā)酵試驗在13 ℃進行，3個重復，靜置發(fā)酵。

1.3.3 發(fā)酵液密度測定及細胞活性分析

發(fā)酵液密度（ρ）的測定通過稱取5 mL（v）發(fā)酵液的質(zhì)量（m）求得（ρ=m/v）[11]；活細胞數(shù)的測定通過亞甲基藍染色后的鏡檢結(jié)果計算[12]；發(fā)酵速度用失重表示，為整個裝置每天所減輕二氧化碳質(zhì)量，二氧化碳質(zhì)量即從發(fā)酵栓中溢出的氣體質(zhì)量測定，每天定時對發(fā)酵栓中發(fā)酵液進行搖勻，使二氧化碳從發(fā)酵栓中溢出直至無氣泡溢出時，對整個發(fā)酵裝置稱質(zhì)量。當二氧化碳的減少量＜0.2 g/（L·d）時認為發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵速度計算公式如下：

式中：V為發(fā)酵速度，g/（L·d）；M1為裝置第N天的總質(zhì)量，g；M2為裝置第N+1天的總質(zhì)量，g；v為發(fā)酵液的體積，L；d為時間，d。

1.3.4 理化指標的測定

葡萄糖、果糖、海藻糖、甘油、琥珀酸、乙酸和乙醇含量通過高效液相色譜測定[13]。將上清液先通過0.22 μm的纖維素膜過濾，再經(jīng)過Aminex HPX-87H色譜柱，流動相為5 mmol/L硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫65 ℃，進樣量10 μL。

1.3.5 酶活性的測定

將干質(zhì)量約10 mg的酵母懸浮于20 mmol/L 4 ℃的羥乙基哌嗪乙磺酸（hepes）（pH 7.1）緩沖溶液中30 min，利用超聲破碎儀使釀酒酵母細胞破碎[14]，將溶液在18 000×g，4 ℃離心30 min，所得上清液為粗酶液。

3-磷酸甘油脫氫酶（3-glycerophosphate dehydrogenase，GPD）的測定：依賴于NAD+的3-磷酸甘油脫氫酶是酵母菌甘油合成的關鍵酶。此酶活的測定是按照參考文獻[15]的方法，略有改動。反應溶液包含20mmol/L（pH7.1）的Hepes緩沖液、20 mmol/L氯化鉀、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L DTT、5 mmol/L磷酸二羥基丙酮（DHAP）和0.1 mmol/L NADH。反應溫度為30 ℃，加入DHAP后反應開始，NADH的減少通過波長340 nm條件下紫外分光光度計測定。溶液中蛋白質(zhì)含量的減少量就相當于消耗的GPD酶量，蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍法[17]。GPD酶活被定義為每分鐘消耗1 μmol的NADH所需的酶量，以U/g表示，計算公式如下：

式中：U為GPD酶活性，U/g；ΔA為單位時間內(nèi)的吸光度值變化；E為消光系數(shù)，ε340=6.2×103/（mmol·cm-1）[16]；L為液層的厚度，cm。

乙醇脫氫酶（ethanol dehydrogenase，ADH）的測定：按照參考文獻[18]的方法，略有改動。反應溶液包括50 mmol/L磷酸二氫鉀，1.0 mmol/L NAD+，pH值為8.0，反應開始加入100 mmol/L的乙醇，反應溫度為30 ℃，波長340 nm條件下紫外分光光度法測定吸光度值?？捡R斯亮藍法測定蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫鍛煉對酵母發(fā)酵動力及其主要代謝物的影響

發(fā)酵溫度和酵母菌種都能夠影響發(fā)酵速率、發(fā)酵時間、酵母生長及代謝物的含量，13 ℃條件下普通酵母菌和低溫鍛煉酵母菌對各種指標的影響見表1。由表1可知，與對照相比，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母B1發(fā)酵時間縮短2 d，發(fā)酵效率提高了7.41%；最大活菌數(shù)增加了8.33%；殘?zhí)橇拷档土?6.28%；乙醇含量增加了4.04%；乙酸含量降低了6.70%。

表1 低溫發(fā)酵對于釀酒酵母發(fā)酵動力及其主要代謝物的影響Table 1 Effect of low temperature on fermentation kinetics and main metabolites of strains

目前研究已經(jīng)證實甘油、海藻糖和琥珀酸等物質(zhì)具有抗低溫的性質(zhì)，在低溫發(fā)酵條件下酵母細胞會大量產(chǎn)生這些抗性物質(zhì)使發(fā)酵得以繼續(xù)進行[19]。然而與對照相比，經(jīng)過低溫鍛煉的酵母產(chǎn)生的抗性物質(zhì)卻有所下降，其甘油產(chǎn)量下降了4.17%；海藻糖產(chǎn)量下降了20.53%；琥珀酸產(chǎn)量下降了2.61%。這種情況的產(chǎn)生很可能是釀酒酵母在低溫鍛煉過程中已經(jīng)產(chǎn)生了抗低溫的能力。

2.2 低溫鍛煉對乙醇、殘?zhí)呛虯DH活性動力曲線的影響

圖1 低溫發(fā)酵對酵母B和B1的殘?zhí)橇?、乙醇產(chǎn)量(A)和ADH活性(B)的影響Fig.1 Effect of low temperature fermentation with yeast B and B1 on residual sugar,ethanol production(A) and ADH activity(B)

圖1A顯示酵母菌B和B1在13 ℃發(fā)酵條件下糖的消耗和乙醇含量的變化趨勢。由于受到低溫的影響，兩種酵母菌進入到酒精發(fā)酵的時間都比較晚，大約5 d左右發(fā)酵才開始啟動。13 d后酒精發(fā)酵和糖的利用率都明顯的減慢，未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株分別在第27天和第25天完成了酒精發(fā)酵的過程，各自產(chǎn)生12.14%和12.63%的乙醇，殘留1.72 g/L和1.44 g/L的糖。

圖1B顯示低溫發(fā)酵下ADH活性的動力曲線。未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株ADH活性都在第8天達到最大值，并且ADH活性在6～13 d都處于較大值。較為不同的是，經(jīng)過低溫鍛煉的菌株其ADH活性比未經(jīng)過低溫鍛煉的要高。這也使得經(jīng)過低溫鍛煉的B1更快地完成酒精發(fā)酵，并且產(chǎn)生更多的乙醇和更少的殘?zhí)恰?/p>

2.3 低溫鍛煉對甘油和GPD活性動力曲線的影響

低溫發(fā)酵對釀酒酵母B和B1的甘油產(chǎn)量和GPD活性的動力學影響見圖2。

圖2 低溫發(fā)酵對酵母B和B1的甘油產(chǎn)量和GPD活性的影響Fig.2 Effect of low temperature fermentation with yeast B and B1 on glycerol production and GPD activity

由圖2可知，低溫發(fā)酵條件下，發(fā)酵10 d以后，未經(jīng)低溫鍛煉和經(jīng)過低溫鍛煉的菌株甘油積累都明顯減緩，并且其前10 d的產(chǎn)量分別到達總產(chǎn)量的70.4%和63.1%。最終甘油的產(chǎn)量分別為10.78 g/L和10.33 g/L。GPD活性最大值都在發(fā)酵第4天達到，然后酶活性迅速下降，10 d后趨于平緩。與未經(jīng)低溫鍛煉的菌株略有不同的是，經(jīng)過低溫鍛煉的菌株的GPD活性在第16天稍有增加，而未經(jīng)低溫鍛煉的菌株B則平緩的下降。

3 結(jié)論

結(jié)果顯示，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母其發(fā)酵速率和酵母活菌數(shù)均高于未經(jīng)鍛煉的釀酒酵母，從而使酒精發(fā)酵時間縮短，有利于成本的節(jié)約。造成這種結(jié)果的原因有可能在于經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母可以使LOT1基因誘導表達，增加了酵母體內(nèi)的不飽和脂肪酸的含量，從而增強了酵母耐受低溫的抗性，使活菌數(shù)增加，發(fā)酵速率加快。另外，又可使酵母耐受酒精的能力增強[20]。

葡萄酒發(fā)酵過程中，釀酒酵母需要持續(xù)應對多種脅迫條件。為了能夠繼續(xù)生長，其產(chǎn)生了多個抗性分子，其中包括甘油、海藻糖、琥珀酸等。然而經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母在產(chǎn)生這些抗性分子方面卻少于未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母。造成這種情況的原因有可能是經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母使得體內(nèi)已經(jīng)產(chǎn)生了針對低溫脅迫的應答，或者其產(chǎn)生了許多的抗低溫的分子，比如糖原等[21]。

酒精發(fā)酵過程中，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母酒精產(chǎn)量比未經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母增加了4.04%，殘?zhí)橇肯陆盗?6.28%，ADH的活性也有所提高。這些結(jié)果很可能是由于低溫鍛煉的釀酒酵母使ADH1基因表達量增加，從而提高了ADH的活性，使其產(chǎn)生更多的乙醇。另外，這也可能是因為經(jīng)過低溫鍛煉使釀酒酵母活菌數(shù)增加，提高了糖的利用率，從而提高了乙醇產(chǎn)量。

葡萄酒發(fā)酵過程中，經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母其GPD酶的最大活性略低于未經(jīng)低溫鍛煉的釀酒酵母，而且在整個發(fā)酵的前期過程中也略低于對照組，最終的甘油、海藻糖和琥珀酸等具有抗低溫性質(zhì)的物質(zhì)產(chǎn)量也低于對照組，但經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母的乙醇產(chǎn)量卻高于對照組。結(jié)果表明，雖然低溫鍛煉使釀酒酵母GPD酶活性略有降低，但經(jīng)過低溫鍛煉使釀酒酵母產(chǎn)生了抗低溫的性質(zhì)。

經(jīng)過低溫鍛煉的釀酒酵母如果能適應低溫發(fā)酵的脅迫條件，對于很多只能在低溫發(fā)酵的葡萄酒酒種質(zhì)量的提高將會有很大的幫助，并且這種研究對于馴化篩選適應低溫發(fā)酵的釀酒酵母都有理論的意義。

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