泛素特異性修飾酶2-69對(duì)大鼠系膜細(xì)胞內(nèi)飾膠蛋白聚糖表達(dá)和泛素化降解的調(diào)節(jié)

駱偉麗 茅 幸 孫建勇 趙仲華 張志剛，3 吳慧娟，3

?

·論著·

泛素特異性修飾酶2-69對(duì)大鼠系膜細(xì)胞內(nèi)飾膠蛋白聚糖表達(dá)和泛素化降解的調(diào)節(jié)

駱偉麗1，2茅 幸1，3孫建勇4趙仲華1張志剛1，2，3吳慧娟1，2，3

目的研究泛素特異性修飾酶2-69(USP2-69)對(duì)系膜細(xì)胞(MC)內(nèi)飾膠蛋白聚糖(DCN)表達(dá)和泛素化的調(diào)節(jié)作用。方法①培養(yǎng)MC細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)大鼠腎MC內(nèi)USP2-69的表達(dá)；②采用免疫共沉淀、激光共聚焦和免疫熒光法，檢測(cè)MC內(nèi)USP2-69是否與DCN結(jié)合，并觀察兩者在MC內(nèi)的定位；③將pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MC后，用Western blot法檢測(cè)HA、USP2-69和DCN的蛋白表達(dá)，用免疫共沉淀法檢測(cè)DCN的泛素化水平；④采用USP2-69 siRNA處理MC，用PCR檢測(cè)USP2-69和DCN的mRNA表達(dá)，用time-course Western blot法檢測(cè)DCN的半衰期， Western blot法檢測(cè)DCN的下游效應(yīng)分子(TGF-β1和Col Ⅳ)的蛋白表達(dá)。結(jié)果① USP2-69在MC、肝細(xì)胞(BRL-3A)和足細(xì)胞(GEC)內(nèi)均有表達(dá)，其在MC內(nèi)的基礎(chǔ)蛋白表達(dá)水平顯著高于BRL-3A和GEC[MCs：(0.27±0.05)，BRL-3A：(0.035±0.009)，GEC：(0.012±0.004)，P<0.01]。② MC總蛋白經(jīng)DCN抗體免疫沉淀后，可檢測(cè)到USP2-69的表達(dá)；經(jīng)USP2-69抗體免疫沉淀后，可檢測(cè)到DCN表達(dá)；且在MC胞質(zhì)內(nèi)，代表USP2-69蛋白的熒光與代表DCN蛋白的熒光存在共定位。③ 轉(zhuǎn)染pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒的MC內(nèi)可檢測(cè)到代表外源性USP2-69表達(dá)的HA蛋白，USP2-69和DCN蛋白表達(dá)的升高，同時(shí)DCN的泛素化水平明顯降低。④ 經(jīng)USP2-69 RNA干擾的MC內(nèi)DCN的mRNA水平?jīng)]有明顯改變，但其半衰期明顯縮短(3 h)，且TGF-β1和Col Ⅳ的蛋白表達(dá)均明顯升高。結(jié)論大鼠腎MC內(nèi)USP2-69可與DCN相結(jié)合，及兩者在胞質(zhì)內(nèi)共定位，USP2-69能夠降低MC內(nèi)DCN的泛素化水平及提高DCN蛋白總量并促進(jìn)其功能。

飾膠蛋白聚糖； 泛素特異性修飾酶2-69； 系膜細(xì)胞

飾膠蛋白聚糖(DCN)是一種可由腎小球系膜細(xì)胞(MCs)分泌、富含亮氨酸的蛋白聚糖，在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)合成、組成和細(xì)胞生長(zhǎng)等方面都發(fā)揮重要作用[1]。DCN的過(guò)表達(dá)可抑制體外培養(yǎng)MC的生長(zhǎng)及其TGF-β1和Col Ⅳ的蛋白表達(dá)，提示DCN是防治腎小球腎炎及阻止腎小球硬化的潛在靶點(diǎn)[2]。本課題組前期已證實(shí)MC內(nèi)DCN通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑(UPP)降解[3]。UPP是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解和功能的一個(gè)重要系統(tǒng)，其對(duì)多種細(xì)胞的生理活動(dòng)有重要作用。同時(shí)，UPP是一個(gè)可逆的過(guò)程，即細(xì)胞內(nèi)還同時(shí)存在一些特異性的去泛素化酶，后者能阻礙靶蛋白的降解而對(duì)其形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[4]。泛素特異性修飾酶2-69(USP2-69)是一個(gè)在腎組織內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)的去泛素化酶。本課題組前期發(fā)現(xiàn)，USP2-69與系膜增生性腎炎的疾病進(jìn)展相關(guān)[5]，但USP2-69是否與DCN密切相關(guān)，目前還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用免疫共沉淀、激光共聚焦和基因轉(zhuǎn)染等技術(shù)，觀察MC內(nèi)USP2-69和DCN的結(jié)合及定位，以及USP2-69對(duì)DCN的泛素化、細(xì)胞內(nèi)DCN蛋白水平和DCN功能的影響，以期為治療系膜增生性腎小球腎炎尋找新的作用靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 方法

1.1 抗體和試劑 鼠抗DCN抗體購(gòu)自R&D 公司，鼠抗ub抗體購(gòu)自 Santa Cruz Biotechnology 公司，鼠抗HA-TAG抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technology公司，兔抗Col Ⅳ、鼠抗TGF-β1和 兔抗USP2-69購(gòu)自 Abcam 公司，兔抗USP2 抗體(可檢測(cè)USP2-69和USP2-45)購(gòu)自 Protein Tech Group，鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自 Sigma-Aldrich公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG購(gòu)自Jackson公司。 Cycloheximide 購(gòu)自 Beyotime公司，Protein-A Sepharose CL-4B 購(gòu)自 Amersham Biosciences Limited。其他試劑購(gòu)自上海生工公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠MC是本實(shí)驗(yàn)室自雄性SD大鼠的腎皮質(zhì)分離獲得；大鼠腎足細(xì)胞(GEC)由陳廣平博士(Department of Cell Biology, Emory University School of Medicine, Atlanta, 美國(guó))惠贈(zèng)；大鼠肝臟細(xì)胞(BRL-3A)由本系張錦生教授惠贈(zèng)(購(gòu)自上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù))，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞為6～15代。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，采用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、95%空氣飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)，適時(shí)傳代。

1.3 細(xì)胞免疫熒光和激光共聚焦 以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于放有18 mm×18 mm蓋玻片的3.5 cm2培養(yǎng)皿中，甲醇和冰醋酸以3∶1的比例混合后4℃預(yù)冷，固定細(xì)胞15 min, PBS室溫清洗細(xì)胞5 min×3次；加入抗USP2抗體、抗USP2-69抗體和抗DCN抗體和二抗工作液，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察MC內(nèi)USP2-69和DCN的蛋白表達(dá)及定位，并拍照。

1.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，按照1×106·mL-1的密度接種MC至6 cm2培養(yǎng)皿中，更換無(wú)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)12～24 h，使細(xì)胞達(dá)到90%～95%融合。在Eppendorf管中制備溶液A(0.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM中加入8 mg pRK5-USP2-69kD-HA真核表達(dá)質(zhì)粒DNA)和溶液B(0.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM中加入20 mL LipofectamineTM2000)，室溫放置5 min；將溶液A和B輕柔混合，室溫放置20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；同時(shí)用PBS洗滌細(xì)胞2次，無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM洗滌細(xì)胞2～3次，加入3 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM；將質(zhì)粒DNA-LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中，輕柔混合均勻；6 h后棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，改用含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后回收細(xì)胞并提取蛋白。

1.5 RNA干擾 轉(zhuǎn)染前1 d，按照5×105·mL-1的密度接種MC至10 cm2培養(yǎng)皿中，更換無(wú)抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)12～24 h，使細(xì)胞達(dá)到50%～60%融合。在Eppendorf管中制備溶液C(1.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM中加入30 mL USP2-69 siRNA)和溶液D(1.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM中加入30 mL LipofectamineTM2000)，室溫放置5 min；將溶液C和D輕柔混合，室溫放置20 min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物；同時(shí)用PBS洗滌細(xì)胞2次，無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM洗滌細(xì)胞2～3次，加入7 mL無(wú)血清培養(yǎng)基Opti-MEM；將USP2-69 siRNA -LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入培養(yǎng)皿中，輕柔混合均勻；6 h后棄轉(zhuǎn)染復(fù)合物，改用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至72 h。 USP2-69-siRNA引物, sense: 5′-AGCCGUUCUGAGUACCUAATT-3′, anti-sense: 5′-UUAGGUACUCAGAACGGCUGG-3′ (由Takara公司設(shè)計(jì)并合成)。

1.6 總RNA提取和RT-PCR 總RNA提取按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為25 μL反應(yīng)體系，包含2 μg的總RNA，1 μL M-MLV (200 U·μL-1) 逆轉(zhuǎn)錄酶和 3 μL Oligo (dT)18 (100 ·μL-1)。PCR條件為95℃變性12 min，后95℃變性45 s，以56℃(DCN)、60℃(USP2-69)或58℃(β-actin)退火30 s，72℃延伸40 s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物5 μL，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。PCR引物如下：DCN：5′-TGGCAGTCTGGCTAATGT-3′ 和5′-ACTCACGGCAGTGTAG-GA-3′；USP2-69:5′-CAGA-CCCGTGGCAATGAAA-3′和5′-GCTGTTCGATTTCTTCTGGC-3′；β-actin:5′-AGGATGCAG-AAGGAGATTACTGC-3′和 5′-AAAACGCAGCTCAGTAACAG-TGC-3′。DCN、USP2-69和β-actin的PCR產(chǎn)物大小分別為199、146和220 bp。

1.7 Western blot和Time-course Western blot 細(xì)胞刮勺輕柔刮下貼壁細(xì)胞后4℃離心(4 000 r·min-1×10 min)，棄上清后加入細(xì)胞裂解液(pH 7.4) ,含有50 mmol·L-1Tris-HCl, 150 mmol·L-1NaCl, 1 mmol·L-1EDTA, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 10% glycerol, 0.2 mg·mL-1NaN3, 1 μg·mL-1pepstatin A, 1 μg·mL-1aprotinin, 1 μg·mL-1leupeptin, 1 mmol·L-1phenylmethylsulfonyl fluoride，裂解細(xì)胞提取蛋白。所獲蛋白經(jīng)SDS-PAGE膠(8%～12%)電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，經(jīng)10%脫脂奶粉封閉后依次加入一抗和二抗，再由ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行分析。為檢測(cè)經(jīng)USP2-69 RNA干擾后MC內(nèi)DCN半衰期的改變，采用Time-course Western blot法，采用10 μg·L-1蛋白合成抑制劑 (CHX)處理MC后，分別于0、6、12、24和48 h終止培養(yǎng)并提取細(xì)胞總蛋白，其余步驟同Western blot。

1.8 免疫共沉淀 100 mg Protein A SepharoseTMCL-4B加1倍體積的TNT buffer，4℃浸泡過(guò)夜。取MC裂解產(chǎn)物2 mg細(xì)胞總蛋白用預(yù)冷的NET buffer (50 mmol·L-1Tris-HCl pH 7.4, 150 mmol·L-1NaCl, 0.1% NP-40, 1 mmol·L-1EDTA, 0.25% gelatin, 0.02% sodium azide, 1 mmol·L-1PMSF, 1% aprotinin)加至0.5 mL，分別加入1 mg抗DCN抗體、抗USP2-69抗體、抗HA抗體或抗Ub抗體，4℃孵育過(guò)夜；加入80 mL Protein A SepharoseTMCL-4B，4℃翻轉(zhuǎn)過(guò)夜；與Protein A SepharoseTMCL-4B結(jié)合的免疫復(fù)合物，用TNT buffer室溫洗3次，NET buffer室溫洗1次，PBS室溫洗1次；加入5′SDS凝膠上樣緩沖液，從Protein A SepharoseTMCL-4B上洗脫免疫復(fù)合物。其余步驟同Western blot，使用抗USP2-69、抗HA抗體、抗Ub抗體或抗DCN抗體檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 USP2-69在MC中的表達(dá) Western blot 結(jié)果表明，與大鼠GEC和BRL-3A相比，USP2-69在大鼠MC中表達(dá)最高[MCs：(0.27±0.05)，BRL-3A：(0.035±0.009)，GEC：(0.012±0.004)，P<0.01]；而USP2的另一亞型USP2-45在BRL-3A中表達(dá)最高， MC次之，在GEC中表達(dá)最低[BRL-3A：(0.17±0.16)，MCs：(0.053±0.046)，GEC：(0.005±0.006)，P< 0.01](圖1)。

圖1 腎系膜細(xì)胞、肝細(xì)胞和腎足細(xì)胞內(nèi)USP2-69與USP2-45的蛋白表達(dá)

Fig 1 The protein expression of USP2-69 and USP2-45 in MCs, BRL-3A and GEC

2.2 MC內(nèi)USP2-69與DCN的結(jié)合和定位 免疫共沉淀結(jié)果顯示，經(jīng)DCN抗體免疫沉淀后的蛋白中，可檢測(cè)出USP2-69的特異性條帶(圖2A)，其位置與未經(jīng)免疫沉淀的MC總蛋白陽(yáng)性對(duì)照泳道上檢測(cè)出的USP2-69條帶位置相同(圖2A)；經(jīng)USP2-69抗體免疫沉淀后的蛋白中，可檢測(cè)出DCN的特異性條帶(圖2B)，其位置與MC總蛋白陽(yáng)性對(duì)照泳道上檢測(cè)出的DCN條帶位置相同(圖2B)；用非特異性IgG免疫沉淀的陰性對(duì)照泳道上均未檢測(cè)出條帶(圖2A、B)。提示MC中DCN可與內(nèi)源性USP2-69結(jié)合。

圖2 免疫共沉淀法檢測(cè)腎系膜細(xì)胞內(nèi)DCN與USP2-69蛋白的結(jié)合

Fig 2 The physical interaction between DCN and USP2-69 in MC was examined by co-immunoprecipitation

Notes The interaction between DCN and endogenous/exogenous USP2-69 in MC. A：IP: DCN，IB: USP2-69；B：IP: USP2-69，IB: DCN；C: IP: DCN,IB: HA;D: IP: HA,IB: DCN

轉(zhuǎn)染USP2-69-HA質(zhì)粒的MC(MCs/USP2-69)蛋白經(jīng)DCN抗體免疫沉淀后，可檢測(cè)出代表外源性USP2-69的HA條帶(圖2C)，其位置與MCs/USP2-69總蛋白陽(yáng)性對(duì)照泳道上檢測(cè)出的HA條帶位置相同(圖2C)；經(jīng)HA抗體免疫沉淀后的蛋白中，可檢測(cè)出DCN的特異性條帶(圖2D)，其位置與MCs/USP2-69總蛋白陽(yáng)性對(duì)照泳道上檢測(cè)出的DCN條帶位置相同(圖2D)；用非特異性IgG免疫沉淀的陰性對(duì)照泳道上均未檢測(cè)出條帶(圖2C、D)。提示MC中DCN可與外源性USP2-69結(jié)合。

激光共聚焦結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)USP2-69蛋白的紅色熒光(胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)[6])與代表DCN蛋白的綠色熒光在胞質(zhì)內(nèi)存在共定位(圖3A～C)。由于該USP2抗體同時(shí)能檢測(cè)到在核內(nèi)表達(dá)的另一亞型USP2-45，故細(xì)胞核也顯示紅色熒光[6]。使用針對(duì)USP2-69抗體進(jìn)行免疫熒光后的結(jié)果顯示，胞漿內(nèi)表達(dá)的USP2-69(綠色熒光)與呈現(xiàn)紅色熒光的DCN蛋白存在共定位(圖3 D～F)。

圖3 腎系膜細(xì)胞內(nèi)DCN與USP2-69的定位

Fig 3 The localization of DCN and USP2-69 in MC

Notes Upper panel: the localization of DCN (A), USP2 (B) and merge (C) in MC by using confocal microscopy. Lower panel: the localization of DCN (D), USP2-69 (E) and merge (F) in MC by using immunofluorescence

2.3 USP2-69對(duì)MC內(nèi)DCN表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與未轉(zhuǎn)染(MCs)和空載轉(zhuǎn)染(MCs/pPK5)相比，經(jīng)pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MC內(nèi)，可檢測(cè)到代表外源性USP2-69 表達(dá)的HA蛋白及USP2-69總蛋白表達(dá)的上調(diào)[MCs/USP2-69-HA：(0.98±0.08), MCs：(0.47±0.04),MCs/pRK5：(0.36±0.06)，P<0.01]；同時(shí)DCN表達(dá)上調(diào)[MCs/USP2-69-HA：(0.93±0.08),MCs：(0.60±0.07),MCs/pRK5：(0.60±0.02)，P< 0.01] (圖4A)。

進(jìn)一步觀察USP2-69對(duì)DCN mRNA水平的影響，發(fā)現(xiàn)MC經(jīng)USP2-69RNA干擾后，DCN mRNA表達(dá)水平無(wú)變化(圖4B)，提示USP2-69對(duì)DCN蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)錄后。

圖4 腎系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)和RNA干擾后mRNA表達(dá)

Fig 4 The protein expression after transfection and mRNA expression after RNA interference

Notes A: The protein expression of HA, USP2-69 and DCN in MC after transfection with pRK5-USP2-69-HA plasmid; B: The mRNA expression of USP2-69 and DCN in MC after USP2-69 RNA interference

2.4 USP2-69對(duì)MC內(nèi)DCN泛素化降解過(guò)程及穩(wěn)定性的影響 免疫共沉淀結(jié)果顯示(圖5A)，與未轉(zhuǎn)染和陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染比較，pRK5-USP2-69-HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的MC內(nèi)DCN的泛素化水平(DCN-Ub)明顯降低[MCs/USP2-69-HA：(22.9±1.5)，MCs：(36.1±1.4)，MCs/pRK5：(39.7±1.2)，P<0.01]。Time-course Western blot結(jié)果顯示(圖5B)，與CHX聯(lián)合siRNA對(duì)照處理相比， 經(jīng)CHX聯(lián)合USP2-69 siRNA處理的MC內(nèi)DCN的半衰期明顯縮短，約為3 h(圖5C)。

圖5 經(jīng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后泛素化DCN和RNA干擾后DCN半衰期的變化

Fig 5The ubiquitinated DCN after trans-ferred and the half-life of DCN after RNA interference

Notes A: The ubiquitinated DCN in MC after transferred with pRK5-USP2-69-HA plasmid; B:The protein level of DCN in MC after USP2-69 RNA interference ; C: The half-life of DCN in MC after USP2-69 RNA interference

2.5 USP2-69對(duì)MC內(nèi)TGF-β1 和 Col Ⅳ蛋

白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與siRNA對(duì)照處理相比，USP2-69 siRNA處理后伴隨著MC內(nèi)USP2-69蛋白表達(dá)降低[(10.4±0.9)vs(16.4±1.2)，P < 0.05]，DCN蛋白表達(dá)降低[(9.6±1.0)vs(19.5±1.9)，P< 0.01]，而TGF-β1[(16.73±1.42)vs(4.73±0.64)，P<0.01]和Col Ⅳ[(14.4±1.1)vs(5.4±0.8)，P< 0.01]蛋白表達(dá)明顯升高(圖6)。

圖6 MC經(jīng)USP2-69 RNA干擾后USP2-69, DCN, TGF-β1 和 Col Ⅳ的蛋白表達(dá)

Fig 6 The protein expressions of USP2-69, DCN, TGF-β1 and Col Ⅳ in MC after USP2-69 RNA interference

3 討論

USP2定位于11號(hào)染色體長(zhǎng)臂(11q23.3)，因mRNA的選擇性拼接而生成2種分子量的亞型，即 USP2-45 和USP2-69，均具有共同的水解核心，但其在N-末端或C-末端存在差異[6]。在對(duì)腎臟的相關(guān)研究中，目前有關(guān)USP2的研究報(bào)道還很少，F(xiàn)lorian等[7]通過(guò)檢測(cè)多種組織USP2亞型的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)腎組織中USP2-69表達(dá)較高。本研究結(jié)果表明，正常MC中USP2-69的基礎(chǔ)表達(dá)水平高于GEC和BRL-3A，且其定位于細(xì)胞質(zhì)，而USP2-45定位于細(xì)胞核，提示兩者在MC中發(fā)揮的功能不盡相同。

去泛素化酶識(shí)別靶蛋白具有一定的特異性，可反向調(diào)節(jié)靶蛋白的泛素化降解。去泛素化酶通過(guò)催化水解泛素分子C-末端的多肽鏈連接(α或ε連接)，將底物蛋白上的多聚泛素鏈水解分離，起到去泛素化作用，阻礙靶蛋白的降解而形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)[8]。在對(duì)USP2-69發(fā)揮去泛素化酶功能的研究方面，目前報(bào)道了6種能被其識(shí)別的靶蛋白：FAS、Mdm2、MdmX、Cyclin D1、Cyclin A1 和 Aurora-A[9～14]。USP2-69能特異性地使這些靶蛋白去泛素化，從而穩(wěn)定靶蛋白并促進(jìn)靶蛋白的生物學(xué)功能。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠腎MC內(nèi)USP2-69不僅與DCN相互結(jié)合及胞質(zhì)內(nèi)共定位，還能通過(guò)使DCN去泛素化，從而增加DCN的蛋白表達(dá)并延長(zhǎng)其半衰期，結(jié)果提示USP2-69是新發(fā)現(xiàn)的DCN的特異性去泛素化酶之一。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)腎小球腎炎時(shí)或經(jīng)體外炎癥因子刺激后，USP2-69的蛋白表達(dá)可上調(diào)，并與腎炎的病理類型相關(guān)，提示MC中USP2-69表達(dá)上調(diào)可能與腎炎發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5]。因此本研究探索了USP2-69是否通過(guò)其對(duì)腎炎拮抗因子DCN的去泛素化從而影響DCN的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP2-69 siRNA處理MC后，伴隨著USP2-69和DCN的蛋白表達(dá)降低，DCN的下游效應(yīng)分子(TGF-β1 和 Col Ⅳ)的蛋白表達(dá)升高。上述結(jié)果表明，USP2-69可通過(guò)使DCN去泛素化以影響DCN下游生物學(xué)活性，從而增強(qiáng)DCN在系膜增生性腎炎中拮抗腎炎和腎小球硬化發(fā)展的作用。

綜上所述，大鼠MC內(nèi)USP2-69可與DCN相互結(jié)合，及兩者在胞質(zhì)內(nèi)共定位，USP2-69可通過(guò)其去泛素化酶作用調(diào)節(jié)DCN的泛素化降解和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量，從而影響DCN的生物學(xué)功能。因此，USP2-69是一個(gè)在防治腎小球腎炎和腎小球硬化中有潛在價(jià)值的重要調(diào)節(jié)因子。

致謝 感謝加拿大McGill大學(xué)Simon Wing教授惠贈(zèng)本課題組pRK5-USP2-69-HA真核表達(dá)質(zhì)粒。

[1]Iozzo RV. The biology of the small leucine-rich proteoglycans. Functional network of interactive proteins. J Biol Chem, 1999, 274(27): 18843-18846

[2]Sun J, Sun Y, Wu H, et al. Transgene therapy for rat anti-Thy1.1 glomerulonephritis via mesangial cell vector with a polyethylenimine/decorin nanocomplex . Nanoscale Res Lett, 2012, 7(1): 451

[3]Wu H, Jiang W, Zhang Y, et al. Regulation of intracellular decorin via proteasome degradation in rat mesangial cells . J Cel Biochem, 2010, 111(4): 1010-1019

[4]Liu CH, Goldberg AL, Qiu XB. New insights into the role of the ubiquitin-proteasome pathway in the regulation of apoptosis. Chang Gung Med J, 2007, 30(6): 469-479

[5]Wang S, Wu H, Liu Y, et al. Expression of USP2-69 in mesangial cells . Pathol Int, 2010, 60(3): 184-192.

[6]Lin H, Yin L, Reid J, et al. Divergent N-terminal sequences of a deubiquitinating enzyme modulate substrate specificity . J Biol Chem, 2001, 276(23): 20357-20363

[7]Haimerl F, Erhardt A, Sass G, et al. Down-regulation of the de-ubiquitinating enzyme ubiquitin-specific protease 2 contributes to tumor necrosis factor-alpha-induced hepatocyte survival. J Biol Chem, 2009, 284: 495-504

[8]Nijman SM, Luna-Vargas MP, Velds A, et al. A genomic and functional inventory of deubiquitinating enzymes. Cell, 2005, 123(5): 773-786

[9]Stevenson LF, Sparks A, Allende-Vega N, et al. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J, 2007, 26(4): 976-986

[10]Kim J, Kim W, Liu Z, et al. The ubiquitin-specific protease USP2a enhances tumor progression by targeting cyclin A1 in bladder cancer. Cell Cycle, 2012, 11(6): 1123-1130

[11]Graner E, Tang D, Rossi S, et al. The isopeptidase USP2a regulates the stability of fatty acid synthase in prostate cancer . Cancer Cell, 2004, 5(3): 253-261

[12]Shan J, Zhao W, Gu W. Suppression of cancer cell growth by promoting cyclin D1 degradation. Mol Cell, 2009, 36(3): 469-476

[13]Allende-Vega N, Sparks A, Lane DP, et al. MdmX is a substrate for the deubiquitinating enzyme USP2a. Oncogene, 2010, 29(3): 432-441

[14]Shi Y, Solomon L, Pereda-Lopez A, et al. Ubiquitin-specific cysteine protease 2a (USP2a) regulates the stability of aurora-A. J Biol Chem, 2011, 286(45): 38960-38968

(本文編輯：丁俊杰)

Effect of USP2-69 on regulating the expression and ubiquitous degradation of intracellular decorin in mesangial cells in rats

LUOWei-li1，2,MAOXing1，3,SUNJian-yong4,ZHAOZhong-hua1,ZHANGZhi-gang1，2，3,WUHui-juan1，2，3

(1DepartmentofPathology; 2ShanghaiInstituteforKidneysandDialysis,ZhongshanHospital,FudanUniversity；3KeyLaboratoryofMolecularMedicine,ChineseMinistryofEducation,SchoolofBasicMedicalSciences；4InstituteofHealthSciences,ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences,ChineseAcademyofSciences,Shanghai200032,China)

WU Hui-juan，E-mail:hjwu@shmu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effects of ubiquitin-specific processing protease 2-69 (USP2-69) on regulating the expression and ubiquitous degradation of decorin (DCN) in mesangial cells (MC). MethodsWestern blot was used to examine the protein expression of USP2-69 in rat MC. Co-IP, confocal and immunofluorescence were used to analyze the interaction between USP2-69 and DCN, and their location in MC. After pRK5-USP2-69-HA eukaryon expression plasmid was transfected into MC, Western blot was used to examine protein expression of HA, USP2-69 and DCN. Co-IP was used to analyze the ubiquitination of DCN. After USP2-69 was knocked down by USP2-69 RNA interference, PCR was used to analyze the mRNA expression of USP2-69 and DCN, time-course Western blot was used to analyze the half-life of DCN and Western blot was used to examine the protein levels of TGF-β1 and Col Ⅳ, two downstream effectors of DCN.Results① USP2-69 was expressed in MC, BRL-3A and GEC, the basal protein expression was higher in MC than in hepatocytes and podocytes[MCs：(0.27±0.05)vsBRL-3A：(0.035±0.009), GEC：(0.012±0.004)，P<0.01]. ② After the total protein of MC was immunoprecipitated by anti-DCN antibody, USP2-69 could be detected. Conversely, DCN could be detected after the total protein of MC was immunoprecipitated by anti-USP2-69 antibody. Moreover, there was a co-localization between fluorescence of USP2-69 and DCN in cytoplasm of MC. ③ Protein expressions of HA which represented extrinsic USP2-69, elevated protein level of USP2-69 and DCN, and an obvious decrease of ubiquitinated DCN was detected in MCs transfected with pRK5-USP2-69-HA plasmid. ④ RNA interference of USP2-69 in MC didn′t change the mRNA level of DCN, but markedly shortened the half-life of DCN from 6 h to 3 h and increased the protein expression of TGF-β1 and Col Ⅳ.ConclusionIn cultured rat MC, a physical interaction and a co-localization in cytoplasm existed between USP2-69 and DCN. USP2-69 could decrease the ubiquitinated form of DCN and increase its protein expression and biological function.

Decorin； Ubiquitin-specific processing protease 2-69； Mesangial cells

國(guó)家自然科學(xué)基金：30900683

1 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理系 上海，200032；2 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院上海市腎病與透析研究所 上海，200032；3 復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海，200032；4 中科院上海生命科學(xué)研究所，健康科學(xué)研究所 上海，200032

吳慧娟，E-mail:hjwu@shmu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.04.012

2015-04-30

2015-06-01)