氯丙嗪致大鼠便秘與炎性細(xì)胞因子表達(dá)的對(duì)照研究

張家瑞　任麗娜　趙均銘　張　勇

作者單位:300222天津市精神衛(wèi)生中心(張家瑞，任麗娜，張勇) ;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所(趙均銘)

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氯丙嗪致大鼠便秘與炎性細(xì)胞因子表達(dá)的對(duì)照研究

張家瑞任麗娜趙均銘張勇

作者單位:300222天津市精神衛(wèi)生中心(張家瑞，任麗娜，張勇) ;中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液學(xué)研究所(趙均銘)

【摘要】目的探討氯丙嗪應(yīng)用對(duì)大鼠腸道炎癥反應(yīng)以及排便習(xí)慣的作用及相關(guān)機(jī)制。方法50只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，氯丙嗪低中高劑量組，以及氯丙嗪聯(lián)合新斯的明給藥共五組，灌胃氯丙嗪兩周以后，考察氯丙嗪對(duì)大鼠排便習(xí)慣以及腸推動(dòng)力的影響;分離提取結(jié)腸組織，采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)以及Western blotting考察氯丙嗪對(duì)前炎性因子，炎性介質(zhì)以及誘導(dǎo)型一氧化氮(NO)合酶(iNOS)、環(huán)氧合酶－2(COX－2)以及核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)表達(dá)的作用。結(jié)果灌胃氯丙嗪(40 mg/kg)兩周以后，與正常對(duì)照組相比，大鼠排便數(shù)量以及糞便含水量分別從(81±15) %，(60±13) %下降至(33±21) %，(25±27) %(P均＜0.05)，分離的大鼠結(jié)腸iNOS，COX－2以及NF－κB分別從(100±11) %，(100±9) %，(100±12) %增加至(289±19) %、(311±28) %、(209±18) % (P均＜0.05)，同時(shí)伴隨著結(jié)腸中相關(guān)細(xì)胞因子以及炎性介質(zhì)的增加。結(jié)論氯丙嗪長(zhǎng)期使用，可使NF－κB活化，繼而激活iNOS和COX－2，前炎性因子以及炎性介質(zhì)進(jìn)一步高表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)腸炎癥。

【關(guān)鍵詞】氯丙嗪;炎癥; COX－2; iNOS

氯丙嗪系吩噻嗪類的經(jīng)典抗精神病藥物，為中樞多巴胺受體拮抗劑，具有抗精神病、鎮(zhèn)吐，以及麻醉鎮(zhèn)靜藥等多種藥理活性［1－4］。

長(zhǎng)期使用氯丙嗪的患者深受便秘的影響［5］，可能是氯丙嗪導(dǎo)致胃腸動(dòng)力的異常與平滑肌動(dòng)力下降有關(guān)。此外，推測(cè)可能與胃腸道的炎癥反應(yīng)有關(guān)，導(dǎo)致炎性腸病，增加結(jié)腸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［6］。但目前有關(guān)氯丙嗪影響腸道肌力導(dǎo)致便秘，及其可能的炎性機(jī)制還不清楚，本研究嘗試通過(guò)大鼠模型試驗(yàn)，分析氯丙嗪對(duì)排便習(xí)慣以及腸道炎性改變的影響，探討氯丙嗪便秘的可能的炎性介導(dǎo)機(jī)制。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組以及給藥方式［7］采用隨機(jī)數(shù)字表法將50只SD雄性大鼠(4～6周，體質(zhì)量160～180g)分為5組，對(duì)照組每日給予2mL生理鹽水灌胃，第2、3、4組分別給予10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg氯丙嗪灌胃處理(灌胃總體積2mL)，最后一組給予40 mg/kg氯丙嗪灌胃加腹腔注射0.25mg/kg新斯的明處理。各組別大鼠共處理14天，第15天進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)前，大鼠自由進(jìn)食進(jìn)水，實(shí)驗(yàn)前一天，禁食不禁水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品氯丙嗪為鹽酸氯丙嗪片(上海醫(yī)藥集團(tuán)信誼制藥，20130301)。氯丙嗪片用生理鹽水溶解至5mg/ml作為儲(chǔ)備液使用。

1.3結(jié)腸組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，環(huán)氧合酶2(COX－2)以及和核轉(zhuǎn)錄因子NF－κB表達(dá)測(cè)定［8］遠(yuǎn)端結(jié)腸分離后，沖洗糞便，按照凱基全蛋白提取試劑盒說(shuō)明(凱基生物，中國(guó))，提取結(jié)腸組織總蛋白并使用碧云天蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物，中國(guó))測(cè)定全蛋白濃度，電泳上樣量為60微克，電泳后轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完畢后，帶有蛋白條帶的PVDF膜使用iNOS抗體(1:1000稀釋) (Abcam公司，香港) 4度孵育過(guò)夜。條帶檢測(cè)和定量采用多光譜成像系統(tǒng)(UVP，劍橋，英國(guó))。結(jié)腸中COX－2以及NF－κB蛋白質(zhì)含量采用和iNOS含量檢測(cè)類似方法研究。孵育抗體分別為COX－2，NF－κB －p65抗體(1:1000稀釋) (Abcam公司，香港)。

1.4結(jié)腸組織中白介素－6(IL－6)、1β(IL－1β)、腫瘤壞死因子α(TNF－α)，以及一氧化氮(NO)和前列腺素－2(PGE－2)含量測(cè)定取灌胃氯丙嗪發(fā)生便秘的大鼠結(jié)腸組織，結(jié)腸中TNF－α，IL－6，IL －1β，以及NO和PGE－2含量采用ELISA試劑盒(BP公司，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。

1.5大鼠排便情況以及腸推動(dòng)率研究每日灌胃前收集大鼠上次灌胃后的糞便數(shù)目，糞便數(shù)目即為上一次灌胃后到本次灌胃前的排便顆粒總數(shù)，以一個(gè)污跡計(jì)算為一顆糞便數(shù)。糞便濕重與糞便干重的差值與糞便濕重的比值即為糞便含水量［9－10］。大鼠腸推動(dòng)率，采用碳末法進(jìn)行研究，腸推動(dòng)率等于碳膜移動(dòng)的距離與幽門到肛門的距離之比［11－12］。

1.6統(tǒng)計(jì)方法使用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，計(jì)量資料以(x—±s)表示。組間比較采用單因素方差分析，P＜0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1氯丙嗪對(duì)大鼠排便習(xí)慣的作用氯丙嗪灌胃兩周后，與正常對(duì)照組相比，糞便數(shù)目減少，糞便含水量減少。見表1。

表1　氯丙嗪灌胃對(duì)大鼠排便影響

2.2氯丙嗪對(duì)大鼠腸推動(dòng)的作用研究15天后，氯丙嗪10mg/kg組(ig)、氯丙嗪20mg/kg組(ig)、氯丙嗪40mg/kg組(ig)、氯丙嗪40mg/kg+新斯的明0.5mg/kg組(ig)腸推動(dòng)率分別為(91±17) %、(65 ±15) %、(44±15) %、(83±2) %，與正常對(duì)照組(100±19) %相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

圖1　氯丙嗪灌胃對(duì)結(jié)腸前炎性因子含量的影響

圖2　氯丙嗪灌胃對(duì)大鼠結(jié)腸炎性介質(zhì)的影響

2.3氯丙嗪誘導(dǎo)炎癥作用氯丙嗪灌胃兩周，分離大鼠結(jié)腸組織，檢測(cè)結(jié)腸組織中炎性因子和炎性介質(zhì)含量。如圖1、圖2所示，氯丙嗪組大鼠結(jié)腸組織中前炎性因子和炎性介質(zhì)的含量相對(duì)于正常對(duì)照組有所增加。灌胃40mg/kg氯丙嗪加腹腔注射新斯的明，并沒(méi)有降低炎性因子以及炎性介質(zhì)的表達(dá)。

2.4氯丙嗪誘導(dǎo)炎癥作用機(jī)制在10mg/kg以及40mg/kg劑量氯丙嗪組大鼠結(jié)腸組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，環(huán)氧合酶－2和NF－κB含量相對(duì)于正常對(duì)照組有所增加。高劑量組灌胃氯丙嗪加腹腔注射新斯的明，并沒(méi)有降低炎性相關(guān)蛋白的表達(dá)。見圖3。

圖3　氯丙嗪灌胃對(duì)炎癥反應(yīng)相關(guān)蛋白的影響

3　討　論

氯丙嗪作為吩噻嗪類的經(jīng)典代表藥物，由于第二代抗精神病藥物的出現(xiàn)，應(yīng)用程度的廣泛性有所下降，但是在長(zhǎng)期住院和經(jīng)濟(jì)困難的精神分裂癥患者中應(yīng)用還是非常廣泛的［1］。氯丙嗪的長(zhǎng)期使用，可導(dǎo)致患者便秘［1－3］。眾所周知，氯丙嗪的抗膽堿作用在一定程度上可導(dǎo)致胃腸推動(dòng)力下降，進(jìn)而誘發(fā)便秘，但是氯丙嗪長(zhǎng)期使用其誘導(dǎo)的便秘的具體機(jī)制，罕見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠模型探討了氯丙嗪導(dǎo)致的便秘是否有炎癥反應(yīng)參與，揭示了氯丙嗪導(dǎo)致便秘的可能的炎性機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子(NF－κB)活性的升高伴隨著炎癥的發(fā)生，可與炎性因子、炎性介質(zhì)的釋放發(fā)生相互促進(jìn)的作用，誘發(fā)炎癥［13－14］。因此本研究考察了氯丙嗪對(duì)NF－κB，iNOS，COX－2蛋白表達(dá)情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，相對(duì)于正常對(duì)照組，氯丙嗪在10mg/kg，20mg/kg以及40mg/kg處理組大鼠均不同程度的出現(xiàn)了便秘現(xiàn)象，表現(xiàn)為糞便數(shù)目以及糞便含水量下將，40mg/kg氯丙嗪處理組大鼠便秘現(xiàn)象最顯著。40mg/kg氯丙嗪灌胃處理加新斯的明腹腔注射，結(jié)果提示新斯的明并沒(méi)有改善大鼠的便秘現(xiàn)象，但是新斯的明對(duì)于氯丙嗪造成的小腸推動(dòng)下將具有顯著的緩解作用，進(jìn)一步提示氯丙嗪造成的便秘與結(jié)腸關(guān)系密切并且氯丙嗪所造成的便秘除抗膽堿機(jī)制外還有其他相關(guān)機(jī)制參與。對(duì)炎癥的研究結(jié)果提示，氯丙嗪可以顯著提高TNF－α，IL－6，IL －1β，以及NO和PGE－2的含量，提高了結(jié)腸iNOS 和COX－2的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果都提示，氯丙嗪長(zhǎng)期使用是可以導(dǎo)致結(jié)腸炎癥的，而這些結(jié)腸炎癥也沒(méi)有通過(guò)新斯的明的治療得到緩解。這些結(jié)果提示，氯丙嗪導(dǎo)致的便秘除與其抗膽堿活性有一定的關(guān)系，還與其導(dǎo)致結(jié)腸的病變有關(guān)系，一般來(lái)說(shuō)，結(jié)腸炎癥會(huì)一定程度上導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生，但是使用氯丙嗪的患者大多受便秘所困擾，因此推論，氯丙嗪長(zhǎng)期使用造成的便秘與便秘型腸易激惹綜合癥類似，既有動(dòng)力的下降也伴隨一定的炎癥反應(yīng)［15－16］，其具體的作用機(jī)制，還需進(jìn)一步研究?？傊?，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，氯丙嗪所造成的便秘是與其導(dǎo)致結(jié)腸炎癥有一定關(guān)系的，但是是否氯丙嗪直接造成了結(jié)腸炎癥繼而誘發(fā)便秘有待進(jìn)一步研究，畢竟氯丙嗪的抗膽堿作用導(dǎo)致的胃腸動(dòng)力下降可以誘發(fā)便秘，而長(zhǎng)時(shí)間的便秘可造成局部的結(jié)腸炎癥［17］。

氯丙嗪以及其他抗精神病藥物，包括其他二代非典型抗精神病藥物，其胃腸道的副作用非常顯著，患者常常深受其困擾［5］。本研究揭示了抗精神病藥物有可能誘發(fā)胃腸道炎癥，而結(jié)腸的炎癥向癌癥轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)很高，同時(shí)胃腸道疾病常常又是導(dǎo)致人類精神焦慮等精神癥狀的主要誘因，因此本研究對(duì)于精神病的藥物治療效果提升以及新藥的開發(fā)提供了一定的科學(xué)信息，同時(shí)提示，對(duì)于抗精神病藥物在臨床應(yīng)用中，應(yīng)重視其胃腸道的副作用。

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論著·臨床

Expression of cytokines is partially involved in the constipation induced by chlorpromazine

ZHANG Jia－rui1，REN Li－na1，ZHAO Jun－ming2，ZHANG Yong11
Tianjin Mental Health Center，Tianjin 300222，China2
Institute of Hematology＆Blood Diseases Hospital，Chinese Academy of Medical Science，Tianjin 300020，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of chlorpromazine on bowel movements as well as intestinal inflammation in rats and uncover the related mechanisms.Methods Fifty male SD rats were randomly divided into 5 groups including normal control，low middle and high dose of chlorpromazine，as well as neostigmine treated chlorpromazine group.After two weeks of the application of chlorpromazine，the effects of Chlorpromazine on rat bowel movements and intestinal propulsion were studied; the expressions of inducible nitric oxide (iNOS) synthase，cyclooxygenase－2 (COX－2)，NF－κB were respectively studied using ELISA and Western blotting methods.Results After two weeks of chlorpromazine application (40 mg/kg)，chlorpromazine significantly decreased the fecal frequency and water from(81±15) %，(60±13) % to(33±21) %，(25±27) % (P＜0.05) ; the corresponding colonic cytokines and inflammatory mediators were significantly increased，which is associated with increased protein expressions of iNOS，COX－2，NF －κB compared with normal control rats from(100±11) %，(100±9) %，(100±12) % to(289±19) %，(311±28) %，(209± 18) %(P＜0.05).Conclusion Chronic use of chlorpromazine leads to colon inflammation through NF－κB activating iNOS/COX－2 pathway.Chlorpromazine is also widely used in Long－term hospitalization and economic difficulties of the patients.

【Key words】Chlorpromazine; Inflammation; iNOS;COX－2

(收稿日期:2015－01－08)

通信作者:張勇，E－mail: zhyzhangyong003@163.com

中圖分類號(hào):R971.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

doi:10.11886/j.issn.1007-3256.2015.02.007