全外顯子組序列分析新生兒FGFR2基因相關(guān)疾病1例

楊 琳 黎籽秀 梅 枚 孫碧君 樊子川 劉 博 王慧君 周文浩

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·論著·

全外顯子組序列分析新生兒FGFR2基因相關(guān)疾病1例

楊 琳1,5黎籽秀2,5梅 枚1孫碧君1樊子川1劉 博3王慧君4周文浩4

目的 通過對1例新生兒期特殊面容、神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)畸形患兒進(jìn)行全外顯子組序列檢測分析，旨在為該患兒尋找潛在的致病原因。方法 納入1例在復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)新生兒病房住院期間未能明確診斷的多發(fā)畸形患兒，主要臨床表型為前額突出、腭弓高、耳位低、枕部較平，雙側(cè)腦室擴(kuò)大、透明隔部分缺如、胼胝體發(fā)育異常，采用SureSelct Human All Exon捕獲試劑盒和Illumina HiSeq2000測序平臺，行全外顯子組序列檢測。數(shù)據(jù)分析采用復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院轉(zhuǎn)化中心所建立的高通量測序數(shù)據(jù)分析流程。采用Sanger測序進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果 患兒全外顯子組序列檢測數(shù)據(jù)，共檢測到79 064個變異，經(jīng)過質(zhì)量控制篩選、變異頻率篩選、變異分類篩選，剩余645個變異。在進(jìn)一步分析中，645個變異中有159個其所在基因在OMIM數(shù)據(jù)庫及HGMD數(shù)據(jù)庫與疾病相關(guān)。從3個已經(jīng)報道的突變位點(diǎn)中鎖定致病突變?yōu)镕GFR2基因(NM_000141)c.C1040G，p.S347C。Sanger測序在家系內(nèi)驗(yàn)證該位點(diǎn)為新發(fā)(denovo)突變。 結(jié)論 采用全外顯子組序列檢測，明確診斷FGFR2相關(guān)疾病1例。并且結(jié)合我院已經(jīng)建立的高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程，為新生兒多發(fā)畸形尋找潛在的致病基因提供了快速、高效的方法。

FGFR2基因； 突變； 全外顯子序列檢測；FGFR2相關(guān)綜合征

新生兒期很多表現(xiàn)為多發(fā)畸形的遺傳相關(guān)綜合征的診斷存在困難。如果能對新生兒期多發(fā)畸形進(jìn)行明確診斷，可以指導(dǎo)臨床早期治療，有效降低傷殘率和病死率[1,2]；對于尚無有效治療方法的多發(fā)畸形，可針對可能出現(xiàn)的并發(fā)癥進(jìn)行規(guī)范化的治療、改善預(yù)后[3]，更重要的是可以為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。 一次性對全外顯子組進(jìn)行序列分析(WES)，為尋找疾病的致病基因和易感基因提供了一種全新研究方法。在近3年中，將WES用于兒科臨床診斷不明的綜合征已經(jīng)取得了很多進(jìn)展 ，至少有150種遺傳性疾病發(fā)現(xiàn)了新的致病基因，或?qū)⒁阎虏』蚺c新的表型建立了關(guān)聯(lián)[4]。

本文以1例多發(fā)畸形新生兒通過WES檢測基因突變，旨在說明WES對于新生兒不典型表型的診斷價值。

1 方法

1.1 臨床樣本信息 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)新生兒病房1例住院期間未能明確診斷的多發(fā)畸形患兒為先證者，收集該先證者核心家系為研究對象。采集先證者新生兒期及3歲2個月隨診時主要臨床表現(xiàn)及影像學(xué)結(jié)果。

本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 DNA提取及全外顯子組捕獲 采用QIAGEN公司mini blood全血試劑盒及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取基因組DNA(gDNA)，用美國Thermofisher公司生產(chǎn)的NanoDrop紫外分光光度儀測定樣本的濃度及定量。參照SureSelct Human All Exon試劑盒說明書，基因組DNA經(jīng)過超聲打斷、末端修復(fù)、接頭連接、雜交捕獲。捕獲文庫采用Illumina HiSeq2000平臺，進(jìn)行序列檢測。

1.3 測序數(shù)據(jù)初步分析 原始數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、比對形成包含變異位點(diǎn)基本信息的vcf文件。

1.4 WES數(shù)據(jù)篩選流程 按照高通量測序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程(復(fù)旦流程)[5]。檢測變異采用ANNOVAR和VEP參照hg19人類基因組參考序列進(jìn)行注釋，對1 000 Genomes phase Ⅲ、ExAC進(jìn)行手工注釋。通過SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)，Polyphen2(Polymorphism Pheno-typing)和MutationTaster軟件，預(yù)測單氨基酸替換對蛋白質(zhì)功能的影響。

1.5 Sanger測序驗(yàn)證 對于檢測到的變異，采用Primer3在線進(jìn)行引物設(shè)計，使用KAPA 2G Robust Hot Start ReadMix進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。通過Sanger直接測序法(3500XL Genetic Analyzer，ABI)進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 先證者，G1P1，孕28周時產(chǎn)前B超發(fā)現(xiàn)雙側(cè)腦室擴(kuò)張，至分娩前腦室擴(kuò)張均<15 mm。孕41周自然分娩產(chǎn)鉗助產(chǎn)，出生體重3 300 g，生后無窒息缺氧史。因“孕28周發(fā)現(xiàn)腦積水”于生后21 h轉(zhuǎn)入我院。查體：體重3 240 g(P10～P25)[6]，身長50 cm(P10～P25)[6]，頭圍35 cm(P10～P25)[6]，前囟5 cm×5 cm，冠狀縫閉合，特殊面容(前額突出，腭弓高，耳位低，枕部較平)。心、肺和腹部查體未見異常。脊柱外觀未見畸形，生理彎曲存在。四肢、指/趾未見畸形，無并指/趾。肌張力稍增高，生理反射可引出。染色體：46，XY。頭顱B超：雙側(cè)腦室及第三腦室擴(kuò)張。頭顱MRI：透明隔部分缺如，側(cè)腦室擴(kuò)大，胼胝體發(fā)育異常(圖1A～C)。超聲心動圖：卵圓孔未閉。TORCH和IgM檢測均陰性。其父母非近親結(jié)婚，孕期否認(rèn)妊娠期高血壓和糖尿病病史?；純焊改阜裾J(rèn)家族遺傳性疾病史。入院診斷：先天性腦積水，腦發(fā)育不良，卵圓孔未閉。住院5 d，頭圍未見進(jìn)行性增大，生命體征平穩(wěn)，可完成奶量，予以出院。

生后4個月，于外院行腦積水腹腔引流術(shù)，因反復(fù)感染，于生后9個月行腦室造瘺術(shù)。生后3歲復(fù)查頭顱CT，腦積水程度較生后未見明顯增加。3歲2個月來我院門診隨診，身高90 cm(P3)[6]，體重15 kg(P25～P50)[7]，特殊面容，頭顱畸形，面中部低平，眼睛突出。牙齒萌出延遲，3歲能獨(dú)立行走但不能跑和跳。能講簡單的詞但不成句。

2.2 全外顯子組測序數(shù)據(jù)分析

2.2.1 先證者WES初步數(shù)據(jù)結(jié)果 數(shù)據(jù)量6 708.1 Mb，平均讀長88.61 bp，目的區(qū)段數(shù)據(jù)量3 737.63 Mb，測序深度54.7，錯配0.24%，目的區(qū)域覆蓋99.6%，側(cè)翼區(qū)域覆蓋97.2%，深度>20×88.5%，比對率98.83%。

2.2.2 WES數(shù)據(jù)分析 圖2顯示， 通過復(fù)旦流程[5]對變異篩選的過程，從79 064個變異(包括SNV及InDel)至159個候選變異用于臨床分析。進(jìn)一步行人工分析：3個為已經(jīng)報道的致病突變位點(diǎn)，2個為新發(fā)現(xiàn)的可能致病位點(diǎn)，12個為新發(fā)現(xiàn)的但致病性不明確的位點(diǎn)，142個已經(jīng)報道但與本文患兒表型不符合的位點(diǎn)。在3個已經(jīng)報道的致病突變位點(diǎn)中：①FGFR2基因(NM_000141)c.C1040G，p.S347C變異與患兒表型相符；②SP110基因(NM_004509)c.C1660T，p.R554X變異與患兒表型不符，且為常染色體隱性遺傳模式疾病，但患兒僅檢測到單一變異。SP110基因突變可導(dǎo)致免疫缺陷相關(guān)的肝血管栓塞及纖維化(MIM：235550)。③CENPJ基因(NM_018451.4)c.2992-6delT變異與患兒表型不符，且為常染色體隱性遺傳模式疾病，但患兒僅檢測到單一變異。CENPJ基因突變可導(dǎo)致小頭畸形(MIM：608393)。

圖1 先證者頭顱MRI所見

Fig 1 MRI findings of the patient

注 透明隔部分缺如，側(cè)腦室擴(kuò)大，胼胝體發(fā)育異常

圖2 WES數(shù)據(jù)篩選流程圖

Fig 2 Flow chart of WES data selection process

注 1)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院內(nèi)部數(shù)據(jù)庫

2.3 Sanger驗(yàn)證 針對FGFR2基因突變采用Sanger測序方法，3500XL序列分析儀(ABI)進(jìn)行檢測驗(yàn)證。引物序列：正向：5′- TCAGTGTTGCTCCGTGTCT-3′， 反向：5′- TGTGTGTGAATTTCCAAGGCA-3′。經(jīng)過Sanger驗(yàn)證，及患兒父母驗(yàn)證，證實(shí)該位點(diǎn)為新發(fā)突變(de novo)。

3 討論

成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)具有促成纖維細(xì)胞有絲分裂、促血管生成和促進(jìn)胚胎組織發(fā)育等多種生物學(xué)活性，在許多涉及細(xì)胞生長、分化、遷移和趨化現(xiàn)象的重要生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8]。成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFRs)家族是一個相互關(guān)聯(lián)且又相互獨(dú)立的酪氨酸激酶受體。該家族具有相似的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，包括3個細(xì)胞外的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，一個膜跨段、胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。FGF-FGFR特異性結(jié)合對于哺乳動物發(fā)育過程至關(guān)重要，這種特異性主要來自于FGFRs可變剪切形成不同的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域3(D3)[9]。FGFR2 mRNA的可變剪切可產(chǎn)生FGFR2b和FGFR2c兩種具有不同組織特異性的單體[10]，分別在外胚層細(xì)胞和間葉細(xì)胞表達(dá)，兩者結(jié)合的FGF配體也各不相同[9]。

FGFs/FGFR2信號通路在骨縫形成和肢芽發(fā)育過程中的重要性已被廣泛報道。由于在顱骨形成過程中FGFR2轉(zhuǎn)錄表達(dá)在成骨形成之前，因此FGFR2信號通路在骨縫生長閉合的過程中對于骨原細(xì)胞的增殖分化至關(guān)重要[11]。FGFR2基因突變可以導(dǎo)致一系列的綜合征，如Crouzon、Apert、Pfeiffer、Jackson-Weiss、Beare-Stevenson、Lacrimoauri-culodentodigital(LADD)綜合征等，也可以引起單一表型，如顱縫早閉、舟狀頭畸形[12～14]。

既往針對FGFR2基因相關(guān)疾病的研究中發(fā)現(xiàn)一些特殊的現(xiàn)象，①相同的位點(diǎn)突變成不同的堿基會表現(xiàn)為2種不同的綜合征。c.1024T>C，p.Cys342Arg，表現(xiàn)為Crouzon綜合征[15]；c.1024T>G，p.Cys342Gly，表現(xiàn)為Pfeiffer綜合征[16]； c.755C>G，p.Ser252Trp，表現(xiàn)為Apert綜合征[17]； c.755C>T，p.Ser252Leu，表現(xiàn)為Crouzon綜合征[18]。②在Apert綜合征中，大多數(shù)患者的突變位點(diǎn)集中在S252W/S252F和P253R，該突變位點(diǎn)位于在編碼胞外第2和第3免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的鏈接部分[19]。上述發(fā)現(xiàn)均體現(xiàn)了FGFR2相關(guān)疾病表型基因型關(guān)聯(lián)的復(fù)雜性。

表1顯示，基于PubMed數(shù)據(jù)庫(建庫至2015年1月31日)總結(jié)的臨床表型，整理并歸納了FGFR2基因突變所導(dǎo)致的Crouzon、Apert、Pfeiffer、Saethre-Chotzen、LADD、Bent Bone Dysplasia和Beare-Stevenson 7種不同的綜合征表型差異。在FGFR2相關(guān)綜合征中，骨骼系統(tǒng)顱骨畸形中顱縫早閉、指/趾畸形和顏面部畸形普遍存在，僅LADD綜合征特征性表型中沒有顱縫早閉表現(xiàn)，面容畸形中眼睛的異常(如干眼癥、鼻淚管阻塞等)亦與其他綜合征有差異。

選取HGMD數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)報道的FGFR2基因的編碼區(qū)突變，根據(jù)所報道的突變位點(diǎn)所導(dǎo)致的疾病，進(jìn)行表型基因型的相關(guān)分析(圖3)。發(fā)現(xiàn)具有FGFR2基因相關(guān)疾病特征性表型的綜合征，突變位點(diǎn)較多集中于第3免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，與既往研究相符合。同時第1免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域及酪氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域也有零散分布。已經(jīng)報道的LADD綜合征的相關(guān)突變位點(diǎn)僅位于酪氨酸蛋白激酶催化區(qū)(圖3C中最下一列的棕色柱狀)，其他結(jié)構(gòu)域中沒有出現(xiàn)突變。故認(rèn)為第3免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域臨近位點(diǎn)突變，可導(dǎo)致以顱縫早閉為特征性表型的FGFR2相關(guān)綜合征[12]。但是FGFR2相關(guān)各個綜合征，從基因型上尚未發(fā)現(xiàn)明顯的突變位點(diǎn)區(qū)分，故仍有待蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)相關(guān)的更進(jìn)一步的分析。

表1 FGFR2基因突變所導(dǎo)致7種不同的綜合征表型

續(xù)表1

本文患兒檢測到的突變位點(diǎn)位于c.1040C>G，p.S347C，既往曾經(jīng)報道該突變會引起Crouzon綜合征[20, 21]。Crouzon綜合征典型表型中累及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀相對較輕，但是本文患兒神經(jīng)系統(tǒng)表型(MRI提示胼胝體發(fā)育不良、透明隔缺失、腦室擴(kuò)張，中等程度智力低下、語言發(fā)育延遲等)較多出現(xiàn)于Apert綜合征，但本文患兒又缺乏Apert綜合征特征性的指/趾畸形表現(xiàn)。故認(rèn)為該患兒可診斷為不典型Crouzon綜合征。

回顧文獻(xiàn)，診斷FGFR2基因相關(guān)疾病的研究，很難建立明確表型基因型的相關(guān)性，也很難從突變位點(diǎn)對不同綜合征進(jìn)行區(qū)分。為何相同基因的缺陷會導(dǎo)致如此多的疾?。炕蛘呤荈GFR2相關(guān)疾病雖然不同程度累及面部、顱骨、神經(jīng)外胚層、軟骨后窩、神經(jīng)嵴源性前顱底、指/趾和皮膚，但是均為同一譜系性疾病，只是個體之間表型的高度異質(zhì)性；又或是其他尚不認(rèn)識的致病因素參與造成了如此復(fù)雜的情況。有待于更多病例的積累和總結(jié)、更多基于組學(xué)水平的研究，更全面的了解遺傳物質(zhì)發(fā)生的變化，明確FGFR2基因相關(guān)綜合征中異質(zhì)性的根本來源。

本課題組對近百例WES數(shù)據(jù)分析實(shí)踐，建立了針對WES家系或先證者復(fù)旦流程。從原始數(shù)據(jù)進(jìn)行了拼接、比對、質(zhì)量控制后，便可進(jìn)入自動化分析流程，在幾分鐘內(nèi)，便可以將WES檢測到的60 000～80 000個變異，通過注釋、篩選，縮減到100～200個人工的判讀。熟練的臨床信息分析人員，根據(jù)詳細(xì)的基因功能、遺傳模式、所致疾病、突變是否影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測等相關(guān)注釋，可以較快的鎖定致病突變，完成分子遺傳學(xué)診斷。

本文病例的診斷實(shí)踐中體會到，①高通量測序技術(shù)以其高度的敏感度和準(zhǔn)確度，能在很短的時間內(nèi)完成對上百億堿基的測序。WES檢測的技術(shù)已經(jīng)日臻完善，目前決定并影響WES在臨床患兒應(yīng)用及推廣的因素不是檢測的時間而是數(shù)據(jù)分析的時間。②目前國內(nèi)醫(yī)院不但缺乏基于二代測序技術(shù)的生物信息分析人員，更缺乏有臨床遺傳學(xué)背景又能很好理解二代測序技術(shù)的臨床信息分析人員。

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(本文編輯：張崇凡)

Exploring the utility of whole-exome sequencing as a diagnostic tool in a newborn with FGFR2 gene related disorder

YANGLin1,5,LIZi-xiu2,5,MEIMei1,SUNBi-jun1,FANZi-chuan1,LIUBo3,WANGHui-jun4,ZHOUWen-hao4(1Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102;2DepartmentofBiostatisticsandComputationalBiology,FudanUniversity,Shanghai200433; 3CentralChinaAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China; 4ShanghaiKeyLaboratoryofBirthDefects，TheTranslationalMedicineCenterofChildrenDevelopmentandDiseaseofFudanUniversity,KeyLaboratoryofNeonatalDiseases,MinistryofHealth,Children'sHospitalofFudanUniversity,Shanghai201102; 5Co-firstauthor)

ZHOU Wen-hao，E-mail:zwhchfu@126.com

ObjectiveIn this study, the whole-exome sequencing was used to identify pathogenic mutations in a newborn with frontal bossing, high-arched palate, low set ear, ventriculomegaly, absent septum pellucidum and agenesis of the corpus callosum.MethodsThe exome targets of the patient's DNA were captured with the SureSelct Human All Exon kit followed by sequencing with the Illumina HiSeq2000 platform. The data analysis pipeline of the Children's Hospital of Fudan University was used for the annotation and variant calling. The detected variant was confirmed with Sanger direct sequencing.ResultsWhole-exome sequencing identified total 79 064 variants in the proband. After filtering of quality, frequency criteria and classification, 645 rare variants were identified. Among these rare variants, 159 variants were mapped to disease-related genes in HGMD or OMIM database. Manual analysis revealed a reported heterozygous mutation (c.C1040G, p.S347C) inFGFR2 gene. Sanger direct sequencing confirmed that it was adenovomutation in the proband.ConclusionWe present a patient withFGFR2 related disorder detected by whole-exome sequencing. This study clearly shows the efficacy of Whole-exome sequencing and our data analysis pipeline for rapid genetic diagnosis of multiple congenital malformations in newborn with an unknown cause.

FGFR2 gene; Mutation; Whole-exome sequencing;FGFR2 related syndrome

上海市衛(wèi)生局重要疾病攻關(guān)項(xiàng)目:2013ZYJB0015；上海市科委/醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)項(xiàng)目子課題：14411950402,14DJ1400103；上海市衛(wèi)計委項(xiàng)目：滬衛(wèi)計科教〔2013〕018號

1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102；2 復(fù)旦大學(xué)生物統(tǒng)計學(xué)與計算生物學(xué)系 200433；3 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 武漢，430070；4 上海市出生缺陷防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)兒童發(fā)育與疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，衛(wèi)生部新生兒疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院 上海，201102 5 共同第一作者

周文浩，E-mail:zwhchfu@126.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2015.01.006

2015-01-03

2015-01-30)