延齡草總皂苷對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

王鳳杰，陳顯兵，張 順，劉錦紅，劉 昕

1.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院（湖北恩施445000）

2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院（湖北 恩施445000）

3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院（湖北恩施445000）

·論著·

延齡草總皂苷對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

王鳳杰1，2，陳顯兵2?，張 順2，劉錦紅3，劉 昕3

1.湖北民族學(xué)院科技學(xué)院（湖北恩施445000）

2.湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院（湖北 恩施445000）

3.湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院（湖北恩施445000）

目的探討延齡草總皂苷（Total saponins of Trillium，TST）對(duì)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。方法雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、延齡草總皂苷50、100、200mg／kg組（TST50，TST100，TST200），后四組采用一次性腹腔注射STZ 40mg／kg復(fù)制糖尿病模型。造模成功后正常組和糖尿病組給予同體積純凈水，其余三組分別給予延齡草總皂苷50、100、200mg／kg／d連續(xù)灌胃給藥10周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死大鼠，取心臟稱重計(jì)算心臟重量指數(shù)（心重／體重）；TUNEL法計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu)改變；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子α（tumour necrosis factorα，TNF－α）、白介素－1β（interleukin－1β，IL－1β）的變化；Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl－2、Bax、Caspase－3的表達(dá)。結(jié)果100和200mg／kg TST均可明顯降低糖尿病大鼠血清中炎癥因子TNF－α（P＜0.01）和IL－1β（P＜0.05）的水平，而50mg／kg TST作用不明顯；不同劑量的TST均可降低糖尿病大鼠心肌組織中Bax的表達(dá)，抑制Caspase－3的活性，而100和200mg／kg TST可增強(qiáng)凋亡抑制蛋白Bcl－2的水平（P＜0.05）。結(jié)論延齡草總皂苷可減輕糖尿病大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)，抑制心肌細(xì)胞凋亡從而保護(hù)糖尿病心肌損傷，有一定的抗炎、抗凋亡作用。

延齡草總皂苷；糖尿?。恍募〖?xì)胞凋亡；炎癥因子

頭頂一顆珠（trillium tschonoskiimaxim，TTM）系百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖（俗稱地珠），其提取物中主要含有甾體皂甙、黃酮苷及倍半萜苷等有效成分［1］，稱為延齡草總皂苷（Total sapo?nins of Trillium，TST），經(jīng)研究證實(shí)其具有抗癌、抗炎、提高免疫力、改善心功能、清除自由基等功效［2］。關(guān)于延齡草總皂苷對(duì)糖尿病的作用研究很少，前期研究中我們已成功構(gòu)建出糖尿病大鼠模型［3］，并且應(yīng)用TTM提取液灌胃處理后，大鼠一般情況、血糖、血脂等指標(biāo)得到明顯改善，本文擬進(jìn)一步研究TST對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、藥品與試劑實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD大鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量150～180 g，購(gòu)于湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015－0018。藥品與試劑：TTM根狀莖及根購(gòu)于湖北省樂(lè)之塬科技有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)于美國(guó)Sig?ma公司；BCA法蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于瑞士羅氏公司；所有抗體均購(gòu)自于美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 TST提取取TTM根狀莖及根烘干粉碎，過(guò)60目篩，用石油醚浸泡3 h后，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾渣為脫脂粗粉；用75%乙醇浸泡數(shù)小時(shí)后回流提取，反復(fù)多次，將提取液濾過(guò)并減壓濃縮、干燥，得總提取物；加水至總提取物全部溶解，用適量乙醚反復(fù)萃取多次，除去濃縮液中的脂溶性成分；脫脂后水飽和正丁醇萃取，減壓濃縮干燥，得延齡草總皂苷，經(jīng)測(cè)定藥品總皂苷含量（18.54mg／g生藥材）。

1.3 糖尿病模型及分組雄性SPF級(jí)SD大鼠50只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、糖尿病組、不同劑量TST（mg／kg）組（TST50，TST100，TST200），每組10只，后四組給予一次性腹腔注射STZ40mg／kg復(fù)制糖尿病模型，3 d后測(cè)空腹血糖，連續(xù)2次血糖＞13.9 mmol／L，且有多飲、多食、多尿的大鼠為造模成功，用于后期實(shí)驗(yàn)，此時(shí)DM組和TST50組各有一只大鼠死亡，其余動(dòng)物正常至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。TST各組分別用延齡草總皂苷50、100、200mg／（kg·d）連續(xù)灌胃給藥10周；正常組和糖尿病組給予同體積純凈水灌胃，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠行各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 血液生化指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即處死取血，檢測(cè)血清中TNF－α和IL－1β水平；完整取出心臟，剪除包膜、大血管等，稱重；計(jì)算心重指數(shù)［心臟體重指數(shù)（CWI）＝心臟質(zhì)量（mg）／大鼠體質(zhì)量（g）］。

1.4.2 HE染色觀察心肌結(jié)構(gòu) 將5mm×5mm×5 mm的左室心肌組織浸入4%多聚甲醛液中固定，常規(guī)石蠟包埋后連續(xù)切片，切片厚度約4μm，放入溫水中伸展并貼片，置于60℃攤片機(jī)中烘烤1 h，石蠟切片經(jīng)脫蠟等步驟后進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察心肌的顯微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)［4］采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的原位缺口末端標(biāo)記（terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP－biotin nick end labeling，TUNEL）法：4%甲醛固定心肌組織，石蠟包埋，制成4μm厚切片，每只大鼠制作10張切片，按TUNEL試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，應(yīng)用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算凋亡指數(shù)。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野（×400），分別計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞核和正常細(xì)胞核，凋亡細(xì)胞核固縮，呈棕色，凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）為凋亡細(xì)胞核與正常細(xì)胞核比值的平均值。

1.4.4 Western blot檢測(cè)Caspase3，Bax，Bcl－2表達(dá)取備用心室肌組織，用含有PSMF的裂解液在冰上裂解，加入上樣緩沖液，煮沸10min，然后將總蛋白在80V條件下進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2h，加入一抗孵育4℃過(guò)夜。TBS－T洗滌3次，室溫下孵育二抗2h，PBS洗膜3次每次10min，暗室加發(fā)光劑2min壓片，顯影，定影，水洗，以β－actin為內(nèi)參照，用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)測(cè)定各目的條帶吸光度比值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間比較采用單因素方差（one－way ANOVA）分析或t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠CWI及血清中TNF－α和IL－1β含量情況與正常組相比，糖尿病大鼠血清中TNF－α和IL－1β水平明顯升高（P＜0.05）；100及200mg／ kgTST灌胃可分別降低TNF－α和IL－1β至（152.00 ±16.65）ng／L，（143.35±4.82）ng／L（P＜0.01）和（10.50±1.05）ng／L，（11.07±1.17）ng／L（P＜0.05）。而50mg／kg TST灌胃對(duì)IL－1β的水平無(wú)明顯改變。不同劑量的TST灌胃均可降低大鼠心臟重量指數(shù)，見(jiàn)圖1。

2.2 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察可看出：正常組大鼠心肌纖維層次清晰、排列規(guī)則，細(xì)胞核藍(lán)染，細(xì)胞間隙均勻，未見(jiàn)明顯炎細(xì)胞及纖維化；糖尿病組心肌細(xì)胞排列紊亂，散在肌纖維變性、胞漿粗顆粒狀，間質(zhì)水腫、大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域可見(jiàn)膠原纖維增生；TST治療后炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度及細(xì)胞水腫現(xiàn)象明顯減輕，間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)明顯異常。見(jiàn)圖2。

圖1 各組大鼠心重指數(shù)及血清中TNF－α和IL－1β含量情況

圖2 心肌組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)（HE，×400）

2.3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)與正常組比較，糖尿病組及TST50組大鼠心肌凋亡指數(shù)明顯增加（P＜0.05）；與糖尿病組相比，100和200mg／kg TST治療可降低糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（P＜0.05）。

圖3 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI%，±s）

2.4 Westernblot檢測(cè)Caspase3，Bax，Bcl－2表達(dá)與正常組比較，糖尿病組凋亡抑制蛋白Bcl－2表達(dá)明顯降低（P＜0.05），促凋亡蛋白Caspase3，Bax的表達(dá)增強(qiáng)（P＜0.05）。與糖尿病組比較，50mg／kg TST組心肌組織中Caspase3，Bax表達(dá)無(wú)明顯變化（P＞0.05），Bcl－2表達(dá)明顯增高（P＜0.05）；而100和200mg／kg TST組Caspase3，Bax表達(dá)降低，Bcl－2表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 心肌組織中Caspase3，Bax，Bcl－2表達(dá)（Western blot）

3 討論

糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，心肌內(nèi)炎癥反應(yīng)的激活是主要損傷機(jī)制之一，炎癥因子及促炎細(xì)胞因子在糖尿病的發(fā)展中起重要作用，因此本研究主要從炎癥反應(yīng)角度探討TST對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制。TST具有一定的抗炎［1］、抗氧化［2］、抗腫瘤等作用，近年來(lái)多項(xiàng)研究結(jié)果表明抗氧化治療可抑制糖尿病心肌損傷［5］，也有報(bào)道［6－7］證實(shí)糖尿病氧化應(yīng)激與心肌細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，氧化應(yīng)激可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。TNF－α是炎癥反應(yīng)中較早釋放的內(nèi)源性介質(zhì)，在細(xì)胞分化和凋亡中起重要作用［8］，并可誘導(dǎo)IL－1、IL－6等合成，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)進(jìn)展［9］。本組結(jié)果顯示糖尿病時(shí)心肌細(xì)胞凋亡率增加及血清中TNF－α、IL－1β水平明顯升高，100和200mg／kgTST治療后凋亡抑制、炎癥因子濃度降低，而低濃度的TST作用不明顯，有一定的劑量依賴性，證實(shí)TST在抑制心肌細(xì)胞凋亡和減少炎癥因子產(chǎn)生方面可能與某些臨床藥物的效果相同，因此推測(cè)TST具有保護(hù)糖尿病心肌損傷作用。

糖尿病心肌病發(fā)生與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)［6－7，10］，但是糖尿病時(shí)心肌細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，其中caspase3是公認(rèn)的凋亡轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要因子，caspase3激活后凋亡不可避免的發(fā)生，結(jié)果顯示糖尿病時(shí)心肌組織中caspase3表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率也增加。我們還發(fā)現(xiàn)糖尿病時(shí)大鼠心肌細(xì)胞肥大、排列紊亂，間質(zhì)水腫、大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少量纖維組織增生，另可見(jiàn)小血管內(nèi)膜增生等，這可能是心臟擴(kuò)大和心臟重量指數(shù)增大的原因，是心肌組織對(duì)糖尿病早期損傷的綜合性反應(yīng)。進(jìn)一步研究顯示糖尿病大鼠心肌組織中Bcl－2蛋白表達(dá)下降，而B(niǎo)ax表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡率增加，可能是糖尿病大鼠Bcl－2／Bax調(diào)控失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡發(fā)生進(jìn)展。而且100和200mg／kg的TST治療后可上調(diào)Bcl－2水平，降低Bax和caspase3活性表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，改善臨床癥狀。人參皂苷Rg1可抑制高糖所致的心肌細(xì)胞肥大［11］，而延齡草有效成分內(nèi)含多種皂苷，可能是其抑制心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)糖尿病時(shí)心肌細(xì)胞損傷的原因；也可能是因?yàn)槎魇┑貐^(qū)延齡草有效成分中含有硒元素，增強(qiáng)了TST的抗炎、抗氧化作用。

總之，TST可明顯抑制糖尿病大鼠體內(nèi)炎癥介質(zhì)TNFα、IL－1β的產(chǎn)生，減輕心肌炎癥反應(yīng)；可通過(guò)促進(jìn)凋亡抑制蛋白Bcl－2的表達(dá)，減弱caspase3的活性，來(lái)抑制糖尿病心肌細(xì)胞凋亡，達(dá)到預(yù)防或延緩心肌病變發(fā)生的作用。關(guān)于其具體作用機(jī)制還有待研究。

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Effects of Total Saponins of Trillium on M yocardial Cell Apoptosis in Diabetic Rats

WANG Fengjie1，2，CHEN Xianbing2?，ZHANG Shun2，LIU Jinhong3，LIU Xin3
（1．Science and Technology College ofHubei University for Nationalities，Enshi445000，China；2．Medical School of Hubei University for Nationalities，Esnhi445000，China；3．Pathology Department in Affiliated Hospital ofHubei University for Nationalities，Esnhi445000，China）

ObjectiveTo exp lore effects of total saponins of Trillium （TST）on m yocardial cell apoptosis in experim ental diabetic rats induced by streptozocin（STZ），and further study the m echanism s of TST．MethodsFiftym ale SD rats，w ere random ly divided into norm algroup、dia?betes m ellitus group，50，100，200m g／kg／d of TST groups（TST50，TST100，TST200）．The later four groups w ere given STZ（40m g／kg）by intraperitoneal injection to duplicate the m odelof di?abetes．After experim ent，the norm al group and diabetic group w ere given the sam e volum e pure w ater，and the other three groups w ere given TSTw ith 50，100，200m g／kg／d in continuous intragastric adm inistration for 10 w eeks．Finally，the rats w ere sacrificed and calculated the car?diac w eight index（cardiac w eight／body w eight，CW I）；the index of m yocardial cell apoptosis w as calculated by TUNELm ethod；m yocardial changes w ere observed by Hem atoxylin and eo?sin（HE）staining；the level of tum or necrosis factor－alpha（TNF－α），interleukin－1 beta（IL－1β）in serum w as detected by Enzym e linked imm unosorbent assay（ELISA）；and the expres?sion of Bcl－2，Bax，caspase－3 related to apoptosis w ere detected by W estern blot．Results100 and 200m g／kg TST can significantly reduce the levels of inflamm atory cytokines TNF－α）（P＜0.01）and IL－1（P＜0.05）in serum of diabetic rats，and 50m g／kg TST has no obvious effect．Different dosage of TST can decrease the expression of Bax and inhibit the activity of Caspase－3，but only w ith 100 and 200m g／kg TST can enhance the expression of Bcl－2（P＜0.05），finally decrease the apoptosis rate ofm yocardial cells．ConclusionTST can protectm yocardial cells by reducing the inflamm atory response in diabetic rats and inhibiting m yocardial apoptosis，w hich has anti－inflamm ation and anti－apoptosis effects．

Total saponins of Trillium；diabetes m ellitus；m yocardial cellapoptosis；inflamm a?tory factor

R587.1

A

1008－8164（2015）04－0001－04

2015－08－16責(zé)任編輯：牟冬生

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（B2015112）。

王鳳杰（1981－），女，山東青島人，碩士，講師，研究方向：中藥藥理與糖尿病發(fā)病機(jī)制；?

陳顯兵（1976－），副教授，研究方向：生物資源的開(kāi)發(fā)與利用。