手性高效液相色譜法測(cè)定恩替卡韋中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)

歐陽婷，楊小玲，麥曦，馬惠玲，程帆，羅恒真，劉陽，劉斌

1.南昌大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330006；2.江西青峰藥業(yè)有限公司，贛州 341000

恩替卡韋(Entecavir) 的化學(xué)名為2-氨基-9-[(1S，3R，4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲基環(huán)戊基]-1，9-二氫-6H-嘌呤-6-酮，恩替卡韋是一種能有效抑制乙肝病毒復(fù)制的脫氧鳥嘌呤核苷類似物，可通過抑制乙肝病毒DNA聚合酶而抑制病毒DNA復(fù)制過程中的啟動(dòng)和延長(zhǎng)步驟，對(duì)乙肝病毒的復(fù)制從起始階段、逆轉(zhuǎn)錄期和DNA依賴性DNA合成期的三個(gè)階段起抑制作用[1,2]。與其他核苷類化合物如拉米夫定(Lamivudine)、噴昔洛韋(Penciclovir)和洛布卡韋(Lobucavir)相比較，Enetcvair具有更高抗HBV活性(hepatitis B virus，HBV)[3]；而且長(zhǎng)期應(yīng)用耐藥的發(fā)生率較低，同時(shí)還具有劑量小、安全性高等優(yōu)點(diǎn)[4]。

恩替卡韋為手性藥物，分子中有三個(gè)手性中心，其有效的構(gòu)型為1S，3R，4S，但在合成過程中可能引入各種光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)，包括非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)和對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，其主成分及主要雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見圖1，非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)主要通過反相高相液相色譜法(RP-HPLC)進(jìn)行限量檢查，但是RP-HPLC難以分離對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)，故本文建立手性高效液相色譜法檢查恩替卡韋中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)限量的方法，為保證本品的安全性、有效性提供了方法依據(jù)。

圖 1 恩替卡韋及主要光學(xué)異構(gòu)體雜質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig 1 The structures of entecavir and principal optical isomer impurities

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

日本島津LC-10AT高效液相色譜儀及SPD-10A紫外檢測(cè)器，正已烷及乙醇均為色譜純，恩替卡韋對(duì)照品(純度：99.7%，江西青峰藥業(yè)有限公司提供)，恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品(純度：99.5%，江西青峰藥業(yè)有限公司)，恩替卡韋六批原料(批號(hào)分別為：20150104、20150114、20150201、20150305、20150316、20150414，江西青峰藥業(yè)有限公司)。

1.2 色譜條件 色譜柱為CHIRALPAK AD-H柱(日本Daicel化學(xué)工業(yè)公司，填料為表面涂敷了直鏈淀粉-三[3，5-二甲基氨基甲酸酯]的球形硅膠，規(guī)格：4.6×250mm，5μm)；流動(dòng)相：正己烷-乙醇(55∶45)；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μL；柱溫：25℃。

1.3 溶液制備 供試品溶液：取本品約25mg，精密稱定，置25m L量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，即得。

對(duì)照溶液：精密吸取1.0m L供試溶液，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，即得。

對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品溶液：精密稱取對(duì)映異構(gòu)體(1R，3S，4R)對(duì)照品約5mg，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲使溶解，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1.0mL，置100mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得。

混合對(duì)照品溶液：分別取恩替卡韋、對(duì)映異構(gòu)體(1R，3S，4R)適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1ml中約含恩替卡韋0.1mg 和約含對(duì)映異構(gòu)體(1R，3S，4R)0.5μg的混合溶液。

圖 2 恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體紫外吸收光譜Fig 2 The ultraviolet absorption spectrum of entecavir enantiomer

2 結(jié)果與討論

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體對(duì)照品溶液在200～400nm間進(jìn)行光譜掃描，掃描圖譜見圖2，結(jié)果顯示恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體在254～256nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇254nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 空白溶劑試驗(yàn) 取流動(dòng)相20μL注入液相色譜儀，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖3，結(jié)果表明流動(dòng)相對(duì)恩替卡韋的異構(gòu)體檢查沒有干擾。

圖 3 空白溶劑色譜圖Fig 3 HPLC chromatograph of blank solvent

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取1.3項(xiàng)下的恩替卡韋、對(duì)映異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液，按1.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見圖4，出峰順序依次為：對(duì)映異構(gòu)體，恩替卡韋，二者的分離度符合要求。

圖 4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜圖Fig 4 HPLC chromatograph of system suitability

表 2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of stability test

2.4 檢測(cè)限 取恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體適量，用流動(dòng)相溶解并逐級(jí)稀釋，按3倍的信噪比計(jì)算，最低檢測(cè)限為1ng。

2.5 精密度試驗(yàn) 取1.3項(xiàng)下的恩替卡韋、對(duì)映異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液20μL注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)平行分析6次，記錄對(duì)映異構(gòu)體的峰面積，結(jié)果見表1，結(jié)果表明方法的精密度良好，方法可行。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1.3項(xiàng)下的恩替卡韋、對(duì)映異構(gòu)體混合對(duì)照品溶液20μL，分別在0，1，2，4，6，8小時(shí)注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，結(jié)果見表2，結(jié)果表明恩替卡韋主成份和對(duì)映異構(gòu)體在流動(dòng)相溶液中放置8小時(shí)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣品中對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)測(cè)定 各批樣品均按“1.3”項(xiàng)下的方法制備成供試品溶液和對(duì)照溶液，取對(duì)照溶液20μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度，使主成份色譜峰的峰高為滿量程的10%；再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液20各μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如有與恩替卡韋對(duì)映異構(gòu)體保留時(shí)間一致的色譜峰，其峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積的0.2倍(0.2%)。結(jié)果6批樣品均未檢出對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)。

[1] Han SB. Natural course, therapeutic options and economicevaluation of therapies for chronic hepatitis B[J]. Drugs, 2006, 66(14): 1831-1851.

[2] Buti M, Esteban R. Drugs in development for hepatitis B[J]. Drugs, 2005, 65(11): 1451-1460.

[3] 陳琨, 歐陽貴平, 任志堯, 汪春梅, 楊金志. 核苷類抗乙肝病毒藥物研究最新進(jìn)展及其合成方法[J]. 精細(xì)化工中間體, 2008, 38(2): 17-22.

[4] Chang T T, Gish R G, Robert G G, et al. A Comparison of Entecavir and Lamivudine for HBeAg-Positive Chronic Hepatitis B[J]. New Eng J Med, 2006, 354(10): 1001-1010.

[5] 國(guó)家藥典委員會(huì), 中華人民共和國(guó)藥典, 四部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 107.