大鼠實驗性牙髓炎痛敏模型的建立及檢驗

高 磊，栗紅師，閆 磊，孫亞男，張 海，吳禮安

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，陜西西安710032；2．解放軍空軍總醫(yī)院，北京100036；3．第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，陜西西安710032）

大鼠實驗性牙髓炎痛敏模型的建立及檢驗

高 磊1，栗紅師2，閆 磊1，孫亞男1，張 海3，吳禮安1

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院兒童口腔科，陜西西安710032；2．解放軍空軍總醫(yī)院，北京100036；3．第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，陜西西安710032）

目的：驗證牙髓暴露法建立大鼠實驗性牙髓炎痛敏模型的可行性。方法：取健康雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為2組；對照組（n＝10）麻醉后不作任何處理，牙髓炎模型組（n＝26）麻醉后于左側(cè)上頜第一磨牙穿髓并使之暴露于口腔。然后，每組中各隨機(jī)抽取6只分別檢測其術(shù)前及術(shù)后1、3、7、14 d的擦面行為。對照組所余4只于術(shù)后2 h取延髓及牙髓，牙髓炎組所余20只分別于術(shù)后2 h取延髓，1、3、7、14 d取牙髓；用免疫熒光染色檢測延髓中c－Fos蛋白及牙髓中TNF－α的表達(dá)，HE染色觀察牙髓炎癥情況。結(jié)果：①牙髓炎組在建模術(shù)后1 d時的擦面總時間最高，其次為術(shù)后3 d組，兩者分別與組內(nèi)其他各時間相比，以及與同一時間點的對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05）；②HE染色顯示，牙髓暴露1 d時即可見明顯炎癥，術(shù)后1、3、7、14 d，其壞死組織的邊緣分別位于髓角和根上、中、下1／3處；③牙髓炎組在術(shù)后1、3、7、14 d各時間點的TNF－α表達(dá)強(qiáng)度的平均光密度值均明顯高于對照組（P＜0．05）；④術(shù)后2 h牙髓炎組和對照組延髓背角的c－Fos陽性細(xì)胞數(shù)為176．8± 14．82和18．2±4．08（P＜0．05）。結(jié)論：牙髓暴露法能有效模擬臨床牙髓炎及其痛敏過程。

開髓；實驗性牙髓炎；痛行為；免疫熒光染色；c－Fos

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：299］

慢性牙髓炎是指發(fā)生于牙髓組織的慢性炎癥病變，臨床表現(xiàn)主要為疼痛。因此，建立一種能有效模擬臨床牙髓炎發(fā)生發(fā)展過程的慢性牙髓炎痛敏模型，對牙髓炎疼痛信息在中樞機(jī)制的研究具有重要意義。國內(nèi)外關(guān)于大鼠實驗性牙髓炎建模的方法很多，如電刺激法、內(nèi)毒素脂多糖誘導(dǎo)法、軟齲置入法等［1］。但這些方法的實驗過程均較復(fù)雜，且條件難以控制，從而使重復(fù)性較差。本實驗采用牙髓暴露法制作大鼠牙髓炎模型，并納入痛行為學(xué)指標(biāo)，分別從疼痛反應(yīng)、牙髓組織形態(tài)學(xué)變化、炎性反應(yīng)及痛覺中樞延髓活化4個方面，驗證大鼠慢性牙髓炎痛敏模型的有效性，以期為后續(xù)慢性牙髓炎的中樞機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1．1 主要材料和設(shè)備

雄性SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供）；Face Grooming觀測儀（UgoBasil，意大利）；高速渦輪機(jī)及1／2圓鉆（Mani，日本）；熒光顯微鏡（Olympus IX71，日本）；兔抗TNF－α、c－Fos抗體（Santa Cruz，美國）；山羊抗兔IgG（H＋L）（Santa Cruz，美國）；DAPI（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1．2 慢性牙髓炎動物模型的建立

取健康雄性SD大鼠36只（體質(zhì)量180～230 g），在室溫20℃、濕度55%的安靜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)（自由飲水進(jìn)食）1周后用于實驗。所有大鼠分別經(jīng)70mg／mL水合氯醛腹腔注射（0．4mL／100 g）麻醉后，從中隨機(jī)抽取10只不作任何處理，用于正常對照；所余26只大鼠分別取仰臥位固定后，開口器撐開口腔，750 mL／L乙醇消毒術(shù)區(qū)，然后用高速渦輪機(jī)及1／2圓鉆于各大鼠左側(cè)上頜第一磨牙近中窩處，間歇性磨除其牙體硬組織，待近髓透紅時，用4．5號注射器針頭（直徑0．45mm）穿髓并使之暴露于口腔。

1．3 痛行為學(xué)測試

建模結(jié)束后，分別從對照組和牙髓炎組中各隨機(jī)抽取6只大鼠用于擦面行為觀察，以評估建模后不同時間大鼠的疼痛反應(yīng)。具體方法為：分別于術(shù)前和術(shù)后1、3、7、14 d各時間點的上午9∶00～11∶00之間，將各大鼠放入Face Grooming觀測儀內(nèi)；待其適應(yīng)環(huán)境5 min后，通過儀器底部的攝像機(jī)進(jìn)行實時拍攝，并分別記錄每只大鼠在3 min內(nèi)擦面行為的總時間。

1．4 取材及組織切片制備

對照組所余4只大鼠于術(shù)后2 h采用心內(nèi)灌注法（含20 IU／mL肝素的生理鹽水＋40 g／L多聚甲醛）處死后，分別取其延髓及包含左側(cè)上頜第一磨牙的上頜骨段。其中延髓組織常規(guī)制備冰凍切片（沿延髓長軸過三叉神經(jīng)脊束核，片厚25μm，隔6取1）；左側(cè)上頜骨組織分別經(jīng)40 g／L多聚甲醛固定2 h、EDTA液脫鈣2周后，常規(guī)石臘包埋，然后沿牙齒近遠(yuǎn)中向、過窩洞制備組織切片（厚度為5μm，隔6取1）。牙髓炎組所余20只大鼠隨機(jī)分為5組（n＝4），其中一組于術(shù)后2 h按上述方法處死各大鼠，并取其延髓制備冰凍切片；另外4組分別于術(shù)后1、3、7、14 d各時間點處死各大鼠，并取其包含左側(cè)上頜第一磨牙的上頜骨段制備石蠟切片（所有方法均同上）。

1．5 延髓c－Fos蛋白免疫熒光染色觀察

分別取對照組、牙髓炎建模術(shù)后2 h組的延髓冰凍切片，按試劑盒說明進(jìn)行延髓c－Fos免疫熒光染色（常規(guī)洗片、透膜、封閉、一抗二抗孵育、封片）后，熒光顯微鏡下觀察；并從每張切片中各隨機(jī)取5個高倍視野（×60），記錄其染色陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。

1．6 牙髓組織HE染色、TNF－α免疫熒光染色觀察

取對照組、牙髓炎建模術(shù)后1、3、7、14 d組牙髓石臘切片，分別進(jìn)行HE染色、TNF－α免疫熒光染色。HE染色：常規(guī)脫蠟復(fù)水、HE染色、脫水透明、中性樹膠封片、光鏡下觀察各組牙髓的組織學(xué)變化。TNF－α免疫熒光染色：常規(guī)烘片、脫蠟復(fù)水、微波爐抗原修復(fù)、一抗二抗孵育、DAPI細(xì)胞核染色、甘油封片，熒光顯微鏡下觀察；并從每張切片中隨機(jī)取5個熒光區(qū)域，用Image J圖像分析軟件（National Institutes of Health開發(fā)）測其平均光密度值，取均值。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 痛行為學(xué)測試結(jié)果

對照組大鼠在各時間點的擦面行為總時間（s）分別為19．0±4．10、19．17±3．76、19．5±5．39、24．67±7．69、21±8．99，各時間點兩兩相比均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；牙髓炎模型組在建模術(shù)前、術(shù)后1、3、7、14 d各時間點的擦面行為總時間分別為17．33±4．93、68．67±9．03、45．17±11．16、22．17±8．72、22．83±7．25，其中以術(shù)后1 d組最高，與其他各時間點相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），其次為術(shù)后3 d組，除明顯低于術(shù)后1 d組（P＜0．05）外，均明顯高于其他各時間點（P＜0．05）；各時間點內(nèi)牙髓炎模型組與對照組兩兩相比，除術(shù)后1、3 d明顯高于對照組（P＜0．05）外，其他各時間點均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0．05）（圖1）。以上結(jié)果提示，牙髓暴露術(shù)后1、3 d均可引起典型的痛行為反應(yīng)，其中以術(shù)后1 d痛行為反應(yīng)最強(qiáng)，隨后逐漸降低。

2．2 牙髓組織HE染色觀察結(jié)果

各組牙髓組織HE染色觀察顯示：①對照組成牙本質(zhì)細(xì)胞排列整齊，牙髓細(xì)胞呈星形，核染色深，胞質(zhì)淡染，并可見部分血管（圖2a）；②牙髓炎組術(shù)后1 d組的牙髓髓角處，可見炎性細(xì)胞浸潤，成牙本質(zhì)細(xì)胞排列部分紊亂，但根髓基本正常（圖2b）；③術(shù)后3 d組可見炎癥已進(jìn)展到根髓上1／3處，冠髓全部壞死，炎性細(xì)胞主要分布于壞死組織斷面（圖2c）；④術(shù)后7 d組可見炎癥已進(jìn)展到根髓中1／3處，深部存活牙髓組織間有散在的炎性細(xì)胞浸潤（圖2d）；⑤術(shù)后14 d組：可見炎癥已進(jìn)展到根髓下1／3處，牙髓幾乎全部壞死，但尚未出根尖孔，未累及根尖周組織（圖2e）。以上結(jié)果表明，牙髓暴露1 d時即表現(xiàn)出明顯炎癥（大量炎性細(xì)胞浸潤），此后牙髓自冠髓至根髓逐漸壞死。

圖1 各組各時間點擦面總時間比較

2．3 牙髓TNF－α免疫熒光染色觀察結(jié)果（圖3）

各組牙髓TNF－α免疫熒光染色：圖中藍(lán)色為DAPI細(xì)胞核染色，綠色為TNF－α免疫熒光染色，TNF－α免疫熒光染色主要表達(dá)于鄰近壞死層的牙髓組織內(nèi)；圖像分析結(jié)果顯示：牙髓炎建模術(shù)后1、3、7、14 d各組的平均光密度值均明顯高于對照組（P＜0．05），其中以1 d組最高，14 d組最低，各組間兩兩相比，除術(shù)后3 d與術(shù)后7 d組P＞0．05外，其他各組間差異均P＜0．05。

2．4 延髓c－Fos蛋白免疫熒光染色觀察結(jié)果

延髓組織中c－Fos蛋白檢測結(jié)果（圖4）所示：c－Fos免疫熒光（綠色）主要分布于延髓背角淺層（圖4a、b）。牙髓炎建模術(shù)后2 h，其延髓背角的c－Fos染色陽性細(xì)胞數(shù)（176．8±14．82）明顯高于對照組（18．2±4．08）（P＜0．05）（圖4c）。以上結(jié)果提示，牙髓暴露2 h即可使延髓背角的細(xì)胞活化。

圖2 各組牙髓組織HE染色觀察（×4）

圖3 各組TNF－α免疫熒光染色觀察（×4）

圖4 對照組和牙髓炎建模術(shù)后2 h組延髓背角c－Fos免疫熒光染色觀察（×4）

3 討論

牙髓炎痛敏模型的選擇，對于后續(xù)研究至關(guān)重要。開髓暴露法操作簡單，不僅能在口腔菌群自然感染環(huán)境下誘導(dǎo)牙髓炎癥，更能模擬臨床慢性牙髓炎的發(fā)生發(fā)展過程。Gibbs等［2］采用牙髓暴露模型法取得了很好的效果。牙髓炎的重要臨床表現(xiàn)為疼痛，以往對牙髓炎模型的研究多聚焦于牙髓組織的病理學(xué)表現(xiàn)及炎癥因子等的表達(dá)變化［3］，本實驗納入痛行為學(xué)及中樞活化等指標(biāo)，從外周、中樞以及痛行為等方面全方位的對實驗性牙髓炎模型進(jìn)行評估和驗證，以期為后續(xù)慢性牙髓炎的中樞機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)。

目前，對疼痛程度的評定主要通過實驗動物的傷害性行為及生理反射來確定。Clavelou等［4］（1989）在福爾馬林顏面部疼痛實驗研究中指出：抓擦注射部位皮膚是一種有效的、可量化的傷害性行為反應(yīng)，可通過測量抓擦持續(xù)時間的長短，來評價三叉神經(jīng)系統(tǒng)受傷害性刺激后產(chǎn)生疼痛的強(qiáng)度。隨后，Chidiac等［5］也發(fā)現(xiàn)，通過記錄大鼠擦面行為的持續(xù)時間，可準(zhǔn)確反映牙髓炎疼痛指標(biāo)。因此，我們選擇擦面行為重要觀測指標(biāo)，通過觀察大鼠痛行為學(xué)變化，從宏觀上反映牙髓炎的痛敏過程，從而驗證實驗性大鼠牙髓炎痛敏模型的有效性。本實驗中，術(shù)后1 d，擦面行為持續(xù)時間達(dá)到最高，隨之逐漸降低；提示疼痛在第1天達(dá)到頂峰，為急性牙髓炎時期，隨后轉(zhuǎn)入慢性，疼痛程度逐漸降低。該結(jié)果表明開髓暴露法建立的牙髓炎痛敏模型非常成功。

痛行為學(xué)檢測可從宏觀上反映牙髓炎的痛敏過程，而病理切片則可從微觀上直接觀察牙髓組織從初期炎癥到后期壞死的全過程。本實驗通過牙髓組織HE染色可見：術(shù)后不同時間，其炎癥自冠髓向根髓逐漸進(jìn)展并發(fā)生漸進(jìn)性壞死；術(shù)后14 d時其炎癥已進(jìn)展至根髓的根尖1／3處，且牙髓幾乎全部壞死，但尚未出根尖孔，未累及根尖周組織。該結(jié)果與Kramer的研究（術(shù)后13 d進(jìn)展到根尖1／3處）基本一致［6］，但與Nakamura［7］的術(shù)后7 d以及Fan［8］的術(shù)后28 d進(jìn)展到根尖1／3處等結(jié)果不同。這可能與開髓孔徑大小、位置和深度有一定的關(guān)系。本實驗均由同一操作者采用1／2圓鉆于左側(cè)上頜第一磨牙近中窩處，間歇式上下垂直提拉（不向四周擴(kuò)展），當(dāng)近髓透紅時，用4．5號注射器針頭（直徑0．45mm）穿髓；同時用探針檢查深度、大小、位置及出血情況，并排除不符合標(biāo)準(zhǔn)的樣品，以保證樣本的均一性。

TNF－α不僅作為重要的炎性介質(zhì)參與炎癥反應(yīng)［9］，而且還能直接增強(qiáng)興奮性突觸的傳遞和削弱抑制突觸效能，誘發(fā)中樞敏化［10］，同時也可以直接作用于初級傳入神經(jīng)元，引起痛覺超敏［11］；因此TNF－α有著連接免疫與神經(jīng)系統(tǒng)的多重作用。Kokkas等［12］發(fā)現(xiàn)TNF－α在不同牙髓炎狀況中的表達(dá)各不相同，且與臨床癥狀的嚴(yán)重程度成正比。本結(jié)果顯示：TNF－α主要分布于壞死牙髓組織的邊緣，其表達(dá)量在牙髓炎建模術(shù)后1 d（疼痛急性期）組的牙髓組織中最高，此后，隨著病程的進(jìn)展而逐漸降低，與Tani－Ishii等［13］報道基本一致。

中樞c－Fos蛋白的表達(dá)是外周傷害性刺激后神經(jīng)元興奮的標(biāo)志，其表達(dá)量可反映外周傷害性刺激的強(qiáng)度［14］。Bhatt等［15］報道，c－Fos蛋白可通過參與調(diào)節(jié)阿片肽基因的表達(dá)，而參與疼痛的中樞調(diào)節(jié)。本實驗發(fā)現(xiàn)，大鼠牙髓暴露后在短時間內(nèi)（2 h）即可觀察到口面部痛覺初級中樞延髓背角內(nèi)c－Fos蛋白的表達(dá)明顯增加；提示c－Fos蛋白表達(dá)靈敏，在炎癥早期即有明顯變化，是一種評價痛覺神經(jīng)元激活的有效指標(biāo)。

綜上所述，牙髓暴露法操作簡單、效果理想，能有效的模擬臨床牙髓炎及其痛敏過程，是一種構(gòu)建實驗性牙髓炎痛敏模型的理想方法。

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Establishment and verification of rat experimental hyperalgesic pulpitis

GAO Lei*，LIHong－shi，YAN Lei，SUN Ya－nan，ZHANG Hai，WU Li－an
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Pediatric Dentistry，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To establish and verify rat experimental hyperalgesic pulpitis．METHODS：36 male SD ratswere randomly divided into2 groups．The rats in control group（n＝10）received no treatmentafter anesthesia，while the leftmaxillary firstmolar pulp of the rats in the pulpitis group（n＝26）were exposed after anesthesia．6 rats of each group were randomly selected for face grooming testbefore and after1，3，7 and 14 d of surgery respectively．Themedulla oblongatas and pulps of the remaining 4 rats in the control group were taken after2 h of surgery．The remaining20 rats in the pulpitis group were randomly divided into5 groups（n＝4），the pulpswere taken after1，3，7 and 14 d of surgery respectively．HE staining，TNF－αand c－Fos immunofluorescence staining were conducted tomeasure the changes of pulp and bulbusmedullae．RESULTS：The face Grooming after 1 d or 3 d of surgery in pulpitis groupswere longer than that in the control group（P＜0．05）．In the pulpitis groups longest face grooming was observed 1d followed by 3 d（P＜0．05）after surgery．HE staining revealed that1，3，7 and 14 d after surgery，inflammation and necrotic tissues appeared at the pulp horn，cervical－third，middle－third and apical－third of the root respectively．Themean optical density of TNF－αat various time points of pulpitis group were significantly higher than that of control group（P＜0．05）．In pulpitis group highest TNF－αlevelwas observed 1d followed by 3 and 7 d after surgery（P＜0．05），the lowest at14 d after surgery（P＜0．05）．c－Fos immunostaining results showed that c－Fos－positive cellswere significantly increased inmedullary dorsal horn after2 h of pulp exposure．CONCLUON：Pulp exposuremethod can effectively establish rat experimental hyperalgesic pulpitismadel，which simulates the process of clinical pulpitis and hyperalgesia．

pulp exposure；experimental hyperalgesic pulpitis；pain－behavior；immunofluorescence staining；c－Fos

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0299－06

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．008

2014－11－21；

：2015－03－24

國家自然科學(xué)基金面上項目（81170929）

陜西省自然科學(xué)基金面上項目（2014JM4114）

高磊（1988－），男，漢族，河南人。碩士生（導(dǎo)師：吳禮安）

吳禮安，E－mail：lianwu＠fmmu．edu．cn