應用Label－free技術研究人牙囊細胞和牙周膜成纖維細胞的差異蛋白質

弓青霞，宋 揚，劉 佳，王麗穎，金作林

（陜西西安：1．軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院正畸科，710032；2．解放軍第323醫(yī)院口腔科，710001）

應用Label－free技術研究人牙囊細胞和牙周膜成纖維細胞的差異蛋白質

弓青霞1，宋 揚2，劉 佳1，王麗穎1，金作林1

（陜西西安：1．軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學重點實驗室，第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院正畸科，710032；2．解放軍第323醫(yī)院口腔科，710001）

目的：應用Label－free蛋白定量技術研究牙囊細胞（hDFCs）和牙周膜成纖維細胞（hPDLFs）差異表達蛋白質，為發(fā)現(xiàn)hDFCs向hPDLFs轉化過程中的重要蛋白質提供參考。方法：應用Label－free蛋白定量技術，結合ultramate 3000 nano－UPLC軟件，對hDFCs和hPDLFs總蛋白提取液進行蛋白定性定量檢測。然后分別對蛋白質的鑒定結果行重復性、關聯(lián)性、蛋白相對含量和差異表達蛋白等進行分析；對總體蛋白質和差異表達蛋白質行生物信息學GO或KEGG分析。結果：hDFCs和hPDLFs蛋白相對含量及總體蛋白GO分析結果相似。定量分析顯示，當hDFCs分化形成hPDLFs后，有22個差異表達蛋白質，其中下調蛋白15個（P＜0．05，F(xiàn)C＞2），上調蛋白7個（P＜0．05，F(xiàn)C＞2）。結論：hDFCs和hPDLFs蛋白質表達譜相似；22個差異表達蛋白質為研究hDFCs向hPDLFs的轉化機制提供了方向。

牙囊細胞（hDFCs）；牙周膜成纖維細胞（hPDLFs）；Label－free定量蛋白組學

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：270］

從發(fā)育的角度講，鐘狀期牙胚的牙乳頭細胞遷移至牙囊，并成為最早的牙囊細胞（human dental follicle cells，hDFCs）［1］，而后者將成為形成牙周組織的始祖細胞。牙周膜成纖維細胞（human periodontal ligament fibroblasts，hPDLFs）作為hDFCs終末分化細胞之一，其轉化過程中涉及復雜的基因、蛋白質表達變化及相應細胞的代謝改變。例如：BMP3是成骨分化和骨形成的負調節(jié)蛋白，在hDFCs向牙周組織發(fā)育后期的細胞中表達上調，通過拮抗BMP2／BMP7的成骨分化和骨形成作用，以維持牙周膜內(nèi)非礦化狀態(tài)［2］，這與Lee等［3］報道的牙周膜中BMP3的表達水平高于牙囊相一致；牙周膜形成初期，牙囊中的間充質細胞獲得極性，增殖分泌功能增加，形成最早的膠原纖維和糖蛋白基質［4］，其他纖維成分如耐酸纖維的早期形成也與hDFCs相關［5］，而牙根發(fā)育完成后，hPDLFs則成為繼hDFCs后實現(xiàn)膠原降解、合成和牙周膜更新改建的主要動力細胞［6－8］。以上研究雖使我們對hDFCs－h(huán)PDLFs轉化過程中的單個基因、蛋白質、細胞因子的表達差異或細胞生命活動有了一定的認識，但關于總體蛋白水平差異的報道極少。

蛋白質組學技術的快速發(fā)展為我們對蛋白質進行大規(guī)模的定性、定量研究提供了方法。其中蛋白定量分析可用以篩選和尋找任何因素引起的不同樣本間蛋白質的差異表達，并能對某些關鍵蛋白質進行定性、定量分析，從而可用于分析干細胞不同分化階段的蛋白質組差別。鑒于hDFCs和hPDLFs在生長發(fā)育上有一定的延續(xù)性，細胞分化處于不同階段，本實驗擬應用Label－free蛋白定量技術研究hDFCs和hPDLFs在分化前后的重要差異蛋白質，以期為研究hDFCs向hPDLFs的轉化機制提供線索。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

α－MEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；I型膠原酶、2．5 g／L胰蛋白酶（Sigma，美國）；細胞總蛋白裂解液、BCA試劑盒（武漢博士德）；羊抗兔IgG／FITC、兔抗人波形蛋白、兔抗人角蛋白（北京博奧森）；SDS－PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天）；考馬斯亮藍R250（西安國安生物科技）；CO2孵箱（Forma，美國）；LTQ orbitrapVelos液質聯(lián)用儀（Thermo，美國）戴安ultramate 3000 nano－UPLC分析軟件（Xcalibur，2．2 SP1）；垂直板電泳槽（Bio－rad，美國）；熒光顯微鏡（奧林巴斯，日本）；凝膠成像儀（Bio－Best，美國）。

1．2 方法

1．2．1 hDFCs、hPDLFs的分離培養(yǎng)

選取12～16歲志愿者因正畸減數(shù)而新鮮拔除的前磨牙10個（均無牙體、牙周疾?。?，立即用PBS沖洗并刮除其冠1／3和根尖1／3的牙齦或牙周膜后，分別置于I型膠原酶中37℃條件下全牙消化3 h。同時選取來自不同患者（均知情同意）、X線顯示第三磨牙阻生且為牙胚狀態(tài)的牙囊10個，將牙囊組織從牙冠表面小心分離后，立即用PBS沖洗，并將其修剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，然后置于I型膠原酶中37℃消化30min。牙囊和離體牙均按照收集順序隨機分配到hPDLFs1、hPDLFs2組或hDFCs1、hDFCs2組，以便于質譜分析。

上述消化結束后，分別收集兩種組織的消化液，并離心棄上清；將各組織的沉淀部分滴加適量α－MEM完全培養(yǎng)液后，分別接種于24孔板，置于37℃、50mL／L CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。待細胞從組織塊邊緣爬出（7～8 d），并爬滿孔底80%時，胰酶消化傳代，取2～3代細胞用于后續(xù)實驗。

1．2．2 hDFCs、hPDLFs的免疫熒光鑒定

取3代hDFCs、hPDLFs分別制備成單層細胞爬片后，40 g／L多聚甲醛固定15 min；PBS沖洗，PBS－Triton透膜20 min；復合消化酶消化3min，5 g／mL BSA室溫封閉30 min。然后分別在hDFCs、hPDLFs爬片上各滴加兔波形蛋白抗體（1∶100）、兔角蛋白抗體（1∶100）4℃過夜。18 h后，避光條件下滴加羊抗兔IgG／FITC（1∶200），37℃孵育20min；PBS沖洗，滴加DAPI（1∶200）室溫孵育7min；封片，熒光顯微鏡觀察。

1．2．3 hDFCs、hPDLFs總蛋白的SDS－PAGE電泳

提取hDFCs、hPDLFs總蛋白質，分別測定其蛋白濃度；將6×Loadingbuffer與各蛋白質提取液按1∶5混合并沸水浴5 min后置于冰上備用；配置120 g／L的SDS－PAGE膠體，連接垂直板電泳槽；兩種細胞蛋白分別取20、35、50 g，加入梳孔，并同時上樣5μL蛋白Marker（10～170KD）進行蛋白質凝膠電泳（壓縮膠60 V、30 min，分離膠100 V、150min）。電泳結束后，考馬斯亮藍染色過夜，洗脫液漂洗膠體后凝膠成像儀照相。

1．2．4 hDFCs、hPDLFs總蛋白質色譜質譜檢測及定性定量分析

分別取hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2 4種蛋白樣品，經(jīng)預處理后用LTQ orbitrap Velos液質聯(lián)用儀及戴安ultramate 3000 nano－UPLC軟件進行分析。上機量分別為10μL，首先進入保護柱（C18 PepMap100，300μm×1mm，5μm，100?），隨后進入分析柱（Acclaim PepMap C18，15 cm×75μm，2μm，100?，Dionex），并以流速0．2μL／min進行分析；流動相B梯度為5%～45%，相應的流動相A梯度是95%～55%（流動相B：乙腈、1．23 g／L甲酸；流動相A：超純水、1．23 g／L甲酸），檢測時間為125 min。質譜參數(shù)：陽離子模式，CID碰撞模式，120 000分辨率，質量范圍350～1 800，NCE為35%，top16離子強度用于串聯(lián)質譜（tandem mass spectrometry，MS／MS）分析。

Orbitrap原始質譜數(shù)據(jù)使用maxquant（1．5．0．12）和Andromeda軟件，并參考IPI人蛋白質數(shù)據(jù)V3．87對蛋白質進行定性。定性檢索方法為：酶切類型為胰蛋白酶全酶切，母離子質量誤差為±10 ppm，固定修飾為Carbamidomethylation（半胱氨酸），可變修飾為G1cNAc（天冬酰胺），Carbamidomethylation（賴氨酸，肽段N端）和Oxidation（蛋氨酸），IPI一個蛋白匹配的多肽最少長7個氨基酸，肽段和蛋白FDR＜0．01，最少匹配unique peptide數(shù)目為1。同時以LFQ和iBAQ兩參數(shù)進行蛋白定量，其中LFQ的對數(shù)（log2）用于后續(xù)蛋白定量分析。

1．2．5 hDFCs和hPDLFs蛋白組分析方案

首先用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件計算相同來源樣本的生物學重復性及定量數(shù)據(jù)的關聯(lián)性。

然后采用DAVID（http：／／david．a(chǎn)bcc．ncifcrf．gov／）和WEGO（http：／／wego．genomics．org．cn／cgib－in／wegoindex．pl）對hDFCs和hPDLFs的總體蛋白質進行GO分類分析。

用SPSS 16．0統(tǒng)計軟件計算hDFCs和hPDLFs中相同蛋白質LFQ值對數(shù)（log2）的比值，用以考察蛋白比例的分布；同時對相同蛋白LFQ值的對數(shù)（log2）進行t檢驗，分析蛋白表達量的差異，并以P＜0．05和倍性變化FC＞2作為最終差異蛋白。

采用DAVID和WEGO對所有蛋白和差異蛋白進行GO分類分析，研究差異蛋白和所有蛋白GO term的異同。采用DAVID對所有差異蛋白進行KEGG Path－way分析。

2 結果

2．1 hDFCs和hPDLFs的鑒定結果

免疫熒光檢測顯示，間充質來源的hDFCs和hPDLFs均陽性表達波形絲蛋白，陰性表達角蛋白（圖1）。

圖1 hDFCs和hPDLFs細胞角蛋白和波形絲蛋白的表達（×10）

2．2 SDS－PAGE電泳結果

hDFCs和hPDLFs的細胞總蛋白質分布均勻，均無極高豐度的蛋白質，符合色譜質譜檢測對蛋白豐度的要求；等上樣量時在10～170 KD二者具有相似的蛋白條帶（圖2）。

2．3 hDFCs和hPDLFs的蛋白質質譜鑒定

在樣本hPDLFs1的二級質譜（MS／MS）中鑒定出2 305個肽段，其中可識別的唯一肽段有1 613個，這些唯一肽段在IPI人蛋白質數(shù)據(jù)庫中可以匹配到565種蛋白質上，其他樣本質譜結果見表1。4樣本共鑒定出907個蛋白組。

表1 hDFCs1、hDFCs2、hPDLFs1、hPDLFs2的質譜鑒定

圖2 hDFCs和hPDLFs的SDS－PAGE電泳

2．4 hDFCs1和hDFCs2、hPDLFs1和hPDLFs2的生物學重復性及數(shù)據(jù)關聯(lián)性分析

hDFCs1和hDFCs2共有68．1%和73．3%的蛋白數(shù)量一致，樣本間蛋白定量的關聯(lián)性為r＝0．73；hPDLFs1和hPDLFs2共有84．3%和65．3%蛋白數(shù)量一致，關聯(lián)性r＝0．87（圖3）。提示，樣本的生物學重復檢測良好，同種樣本間一致程度較高。

圖3 生物學重復性（左）和數(shù)據(jù)關聯(lián)性（右）

2．5 hDFCs和hPDLFs中相同蛋白比例的分布情況

SDS－PAGE顯示，兩細胞間相同分子量區(qū)域內(nèi)蛋白質的豐度極其相似，故對兩細胞同一種蛋白質的定量數(shù)據(jù)（LFQ值）的比值進行柱狀圖分析；從圖中可以看出，其蛋白的比例呈正態(tài)分布，大多數(shù)蛋白的比例均位于1［log2（hPDLCs／hDFCs）＝0］附近（圖4）。

圖4 相同蛋白比值分布

2．6 hDFCs和hPDLFs總體蛋白的GO分析

GO分析顯示，兩種細胞的總蛋白質在大多數(shù)GO分類項目（細胞成分、分子功能、生物過程及其子分類）下非常相似，只有在生物過程下的rhythmic process（節(jié)律性過程）中hDFCs較hPDLFs有更多相關蛋白表達（圖5）。

2．7 差異蛋白分析

對hDFCs和hPDLFs中相同蛋白質進行定量分析后顯示，22個蛋白質表達量的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05，F(xiàn)C＞2），其中下調蛋白質15個（AKR1A1、ALCAM、CDC42、CTGF、CYR61、DDX1、DDX17；DDX5、DDX39A、F2、FKBP4、FST、GDI1；GDI2、MAT2A、RPL18A、TOMM6），上調蛋白質7個（DRAP1、ECI1、EIF3G、HSP90B1、NIT1、PPP1CB、STX7）（圖6）。

圖5 hDFCs和hPDLFs總體蛋白GO分析

2．8 差異蛋白和總體蛋白的GO分析

使用DAVID分析軟件將所有蛋白質和差異蛋白質向GO數(shù)據(jù)庫的各節(jié)點映射后，可見CTGF，CYR61（分化后均下調）在分子功能上富集于胰島素樣生長因子結合蛋白（圖7）。

2．9 差異蛋白質KEGG分析

22個差異蛋白質中只有3個對比到KEGG Pathway，分別為CDC42、F2、PPP1CB，參與細胞骨架調節(jié)相關通路（圖8）。

圖6 差異蛋白質表達譜

圖7 差異蛋白和總體蛋白的GO分析

圖8 差異蛋白質CDC42、F2、PPP1CB的KEGG分析

3 討論

差異蛋白質組學最初應用于干細胞相關研究，可分析不同來源干細胞、干細胞誘導分化前后蛋白質表達的變化［9－11］。hPDLFs是hDFCs最重要的終末分化細胞之一，二者雖然在細胞形態(tài)、免疫熒光及總體蛋白表達譜上均有相似性，但卻處于分化不同階段，是兩種具有組織學延續(xù)性的不同細胞。本實驗借助Label－free蛋白定量技術分析了hPDLFs和hDFCs在蛋白表達水平的相似性和差異性，并觀察了hDFCs成纖維分化前后細胞蛋白表達的改變。

為提高蛋白質定性定量的準確性，本實驗選擇了Label－free蛋白定量技術，該方法區(qū)別于雙向電泳結合質譜法、穩(wěn)定同位素標簽法，是后基因時代發(fā)現(xiàn)蛋白質微量變化中較為精確的方法［12］。同種來源細胞設計樣本重復，在蛋白質生物學重復性和定量數(shù)據(jù)相關性檢驗良好的前提下（圖3），進行兩細胞總蛋白譜和差異蛋白質分析。

hDFCs／hPDLFs各蛋白比例的柱狀圖分析顯示，絕大多數(shù)蛋白的比值分布于1附近，即hDFCs、hPDLFs雖然處于分化不同階段，但是兩種細胞在蛋白質種類及含量上非常相似，多數(shù)蛋白質含量無明顯差異。GO分析進一步證實，兩種細胞總蛋白質在細胞成分、分子功能、生物過程及其相應term中多數(shù)無明顯差異。除去個別差異表達蛋白質（圖6），以上結果提示hPDLFs與hDFCs總蛋白譜在蛋白種類、含量、功能上具有極大的相似性。

差異蛋白質ALCAM、CTGF、CYR61在hPDLFs中下調表達，可能是hDFCs分化后干性降低的標志。CTGF、CYR61在分子功能上屬于胰島素樣生長因子結合蛋白，在胚胎發(fā)育期各種結締組織細胞外基質合成中發(fā)揮重要作用。CYR61能促進成骨、成軟骨分化，愈合中的骨痂較正常骨高表達［13］。咀嚼力刺激可誘導牙周膜內(nèi) CTGF上調［14］；CTGF可促進成骨細胞和軟骨細胞的增殖分化及骨基質礦化［15］。CYR61和CTGF在胚胎發(fā)育早期多種間充質來源的組織中有隨組織發(fā)育表達降低的趨勢［16］。ALCAM的表達蛋白質是活化白細胞粘附因子CD166，作為干細胞標志物在hDFCs和hPDLFs中都有表達［17－18］。由此推測ALCAM、CTGF、CYR61的下調表達，可能是hDFCs逐漸喪失胚胎期干性并最終分化形成hPDLFs的結果，但這需要對牙囊－牙周膜發(fā)育過程行進一步免疫組化驗證。

差異蛋白質中CDC42、F2、PPP1CB可以對比到細胞骨架調節(jié)相關通路。CDC42可以激活蛋白激酶（PAK）通路，從而調控細胞骨架的結構重塑。PPP1CB是蛋白磷酸酶1（PP1）的β催化亞基，后者參與數(shù)千種蛋白質的去磷酸化，與細胞分裂密切相關。F2為凝血酶原，是凝血酶的前體，后者與蛋白酶激活受體結合后具有蛋白酶活性，可以刺激成纖維細胞聚集和收縮［19］。由于牙周膜發(fā)育過程中伴隨咬合力刺激，hDFCs在分化形成hPDLFs的同時，也由牙囊期的細胞無規(guī)則散在排列，逐漸獲得極性，演變?yōu)檠匮乐苣つz原纖維改建方向排列，建牙合不同時期成纖維細胞的長軸與牙根間的夾角不同［20］；此外在牙周膜發(fā)育完成后，機械力刺激可以進一步誘導hPDLFs的細胞骨架沿機械力方向重排［21］。hPDLFs為適應咀嚼力刺激自發(fā)進行細胞骨架調節(jié)的生物學行為區(qū)別于hDFCs，這可能是hDFCs和hPDLFs出現(xiàn)細胞骨架調節(jié)相關蛋白表達差異的主要原因。

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The differential proteom ics of human dental follicle cells and human periodontal ligament fibroblasts analysed w ith Label－free technology

GONG Qing－xia*，SONG Yang，LIU Jia，WANG Li－ying，JIN Zuo－lin
（*State Key Laboratory Of Military Stomatology，Department of Orthodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To identify the differentially expressed proteins of human dental follicle cells（hDFCs）and human periodontal ligament fibroblasts（hPDLFs）with Label－free protein quantification technique．METHODS：Combined with ultramate 3000 nano－UPLC software，Label－free protein quantification was used to examine the total protein extraction samples from hDFCs and hPDLFs．For the proteins identified，the repeatability，the correlation，the relative content of proteins and the differentially expressed proteins of hDFCs and hPDLFs were analyzed．Bioinformatic analysis of GO and KEGG was applied for the analyses of total proteins of hDFCs and hPDLFs，aswell as the differentially expressed proteins．RESULTS：The relative content of proteins and the results of GO analysis of hDFCs swere similar to those of hPDLFs．22 differentially expressed proteinswere identified，ofwhich 15 were down－regulated，7 were up－regulated．CONCLUSION：Label－free quantitative proteomics confirmed the similar proteins profile between hDFCs and hPDLFs．22 differentially expressed proteins provide clues for the transformation mechanism from hDFCs to hPDLFs．

human dental follicle cells（hDFCs）；human periodontal ligament fibroblasts（hPDLFs）；Labelfree quantitative proteomics

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0270－07

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．003

2015－01－09；

：2015－03－24

國家自然科學基金面上項目（81271176）

弓青霞（1986－），女，漢族，河南人。碩士生（導師：金作林）

金作林，E－mail：zuolinj＠fmmu．edu．cn