比較不同方法對新疆部分地區(qū)家畜布魯氏病菌種鑒定

多里坤·努爾沙發(fā) 米吉提·莫合他爾汗 阿曼古力·馬木提

(新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 新疆 烏魯木齊 830011)

布魯氏菌病是世界范圍內(nèi)廣泛流行，尤其是對以畜牧業(yè)為主的發(fā)展中國家造成較大危害的重要人畜共患?。?］。傳統(tǒng)病原學(xué)方法在布魯氏菌病的診斷確診中是金標(biāo)準(zhǔn)、該方法以較高的特異性能夠鑒別不同種型的同時，還能確定疫區(qū)和傳染源，但與PCR 方法比較，前者在耗時、操作安全性、敏感性等方面有明顯差異。PCR 方法在布病病原學(xué)檢測領(lǐng)域中的成功利用，在一定程度上克服傳統(tǒng)方法的上述缺點的同時提高了布魯氏菌株種、屬性鑒定水平，而PCR 方法有抗原不穩(wěn)定等缺點。為此我們設(shè)計運用細(xì)菌分離加分子生物學(xué)的病原學(xué)檢測方案，對我區(qū)部分地區(qū)的牛、羊布魯氏菌菌種進(jìn)行鑒定，同時了解不同菌株在不同動物間是否存在菌種轉(zhuǎn)移情況，達(dá)到通過特異、敏感、安全、快速的檢測方法，確診菌株，實施科學(xué)預(yù)防措施為目標(biāo)，開展了此次檢測鑒定工作，具體檢測鑒定結(jié)果回報如下。

1.材料與方法

1.1 檢測病料及有關(guān)數(shù)據(jù)

在新疆南北疆設(shè)3 個未布病疫苗免疫采樣點共收集病原學(xué)組織(牛、羊流產(chǎn)胎兒)病料263 份，其中羊流產(chǎn)胎兒223 份、牛流產(chǎn)胎兒40 份。流產(chǎn)胎兒所屬畜主、飼養(yǎng)家畜、孕畜、流產(chǎn)、布病免疫情況及家人身體狀況等數(shù)據(jù)信息以填表的方式記錄保存。

1.2 試驗材料

1.2.1 主要試劑

瓊脂粉;胰蛋白示(TRYPTOSE);布魯氏菌試管凝集試驗陽性、陰性血清由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司購置;VirB8 - PCR 試劑及AMOS -PCR 試劑由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供。

1.2.2 儀器耗材

生物培養(yǎng)箱;玻璃干燥缸;PCR 儀;電泳儀;圖像分析儀;一次性培養(yǎng)皿;蠟燭;移液槍頭;微量加樣器等。

1.3 方法

1.3.1 布魯氏菌的分離培養(yǎng)

無菌取牛、羊流產(chǎn)胎兒，肝、脾、胃液等組織及胃內(nèi)容，其中每份牛犢組織病料同時開展需氧和厭氧培養(yǎng)，而羔羊組織病料只進(jìn)行需氧培養(yǎng)［2］，37℃培養(yǎng)7 天，觀察菌落生長情況。挑取可疑菌落、用布魯氏菌陽性、陰性血清進(jìn)行凝集試驗，對在陽性血清中凝集的可疑菌株，進(jìn)行進(jìn)一步純化培養(yǎng)，對純化可疑菌株、采用分子生物學(xué)PCR 方法進(jìn)行分析鑒定。本試驗是用PCR 鑒定試驗代替?zhèn)鹘y(tǒng)布魯氏菌病細(xì)菌學(xué)分離鑒定方法中的生化鑒定試驗，即不開展硫化氫產(chǎn)生、染料抑菌、單項特異血清A、M 及粗糙R 血清凝集、噬菌體裂解試驗等生化試驗。

1.3.2 PCR 方法

取上述細(xì)菌學(xué)方法分離的可疑菌株，用布魯氏菌VirB8 -PCR 和AMOS-PCR 兩種方法不同的試劑按說明進(jìn)行試驗。

2.結(jié)果

2.1 布魯氏菌可疑菌株的分離

細(xì)菌學(xué)分離方法共分離20 株可疑菌株，其中從羊流產(chǎn)胎兒中分離到11 個株菌，牛流產(chǎn)胎兒中檢出9 個株菌。

2.2 VirB8 - PCR 和AMOS-PCR 試驗結(jié)果

從上述20 株可疑菌中，VirB8 - PCR 方法檢出了19 株布魯氏菌(見圖1 部分菌)，但是該試劑不能鑒別該菌的種屬，AMOS -PCR 方法檢出16 株布魯氏菌(見圖2 部分菌)，同時該試劑能鑒別牛種和羊種布魯氏菌，其中9 株羊流產(chǎn)胎兒分離菌株均為羊種布魯氏菌，7 株牛分離菌株均為牛種布魯氏菌，羊種布魯氏菌感染率為3.4%、牛種布魯氏菌感染率為2.6%。檢測結(jié)果顯示不同畜間未發(fā)現(xiàn)布魯氏菌菌種轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。細(xì)菌學(xué)方法及兩種PCR 方法鑒別結(jié)果的對比，詳見表1 和圖3。VirB8 - PCR 布魯氏菌均出現(xiàn)的擴(kuò)增帶為716bp，AMOS -PCR 牛種、羊種布魯氏菌均出現(xiàn)的擴(kuò)增帶分別為498bp 和731bp。

圖1 6 株分離可疑菌株

AMOS- PCR 擴(kuò)增結(jié)果M:Marker.1:羊流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株:1#、2#、3#、4#、5#、6#、8#.牛流產(chǎn)胎兒中分離可疑菌株7#、9#.

表1 細(xì)菌學(xué)方法及兩種PCR 方法鑒別結(jié)果的對比表

圖3 細(xì)菌學(xué)方法及兩種PCR 方法鑒別結(jié)果的對比圖

3.討論分析

3.1 布魯氏菌病的病原學(xué)檢測在布病疫情判斷，成功實施有效防制措施等方面最可靠和重要方法之一。布魯氏菌病細(xì)菌學(xué)檢測方法雖然能從被檢病料中直接檢出致病菌，還能進(jìn)行菌性鑒定和鑒別種、屬，但所需時間較長、比較繁瑣，條件苛刻，檢出陽性率較低［3］，生物安全性差，實驗人員需進(jìn)行嚴(yán)格培訓(xùn)才能操作，因此上述該方法在逐步退出檢測方法行列之中［4］。綜合上述因素，本實驗對細(xì)菌學(xué)方法進(jìn)行簡化，用特異、敏感、相對安全、快速的［5］PCR 方法代替細(xì)菌學(xué)生化鑒定。兩種PCR 方法中VirB8 - PCR 方法較敏感，檢出率高，但只能鑒別布魯氏菌、不能種屬區(qū)分，而AMOS-PCR 方法檢出率低，顯示特異性高，且能鑒別種屬，所以AMOS-PCR 方法推廣運用的價值較高。

3.2 試驗鑒定確診此次引起該流產(chǎn)的病因是牛感染牛種和羊感染羊種布魯氏菌。三種試驗的出菌率方面;細(xì)菌學(xué)方法疑似布魯氏菌出菌率為7.6%，VirB8 - PCR 為7.2%，AMOS -PCR 為6.08%。AMOS -PCR方法，在出菌率方面比細(xì)菌學(xué)方法底1.52 百分點，比VirB8 - PCR 底0.4個百分點。細(xì)菌學(xué)方法與VirB8 - PCR 及AMOS-PCR 方法的符合率，分別為95%和80%。VirB8 - PCR 及AMOS -PCR 的特異性、比細(xì)菌分離方法分別高5 個百分點和20 各百分點，相對而言、特異性最高的是AMOS-PCR 其次是VirB8 - PCR 和分離方法、敏感性相反。對于AMOS -PCR方法未能檢出的4 株菌歸屬問題，在以后的工作繼續(xù)細(xì)菌學(xué)生化鑒定，并且與其它方法對比試驗后、給予評價。AMOS -PCR 方法雖然在特異、便利、安全及快速等方面高于其它兩種方法，但是敏感性需要進(jìn)一步評價。布魯氏菌患病畜群及時進(jìn)行全檢、檢出陽性畜按有關(guān)規(guī)定處理后，未感染家畜進(jìn)行疫苗接種，是保護(hù)人類健康、減少經(jīng)濟(jì)損失、在畜間最終根除該病的最有效的方法和必要措施之一［6］。

3.3 為了更好地了解我區(qū)家畜布病發(fā)病情況和制定有效預(yù)防措施，今后的檢測工作中，需進(jìn)一步加大病原學(xué)檢測工作。開展有針對性的防疫工作的工作中，利用分子生物學(xué)方法對分離菌株的基因序列進(jìn)行分析，準(zhǔn)確掌握菌種特征，為各類預(yù)防措施的及時順利開展，提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

［1］ Marta A，Almiron Norberto，Sanjuan.The Aggregation of Brucella abortus Occurs Under Microaerobic Conditions and Promotes Desiccation Tolerance and Biofilm Formation［J］，Open Microbiol J.2013，7:87-91..

［2］ 李長友，李明，馬世春等.動物布魯氏菌病防治指導(dǎo)手冊［M］.中國農(nóng)業(yè)出版社出版，2012，第一版，第二章，弟一節(jié).

［3］ 李堅，李鐵鋒，王艾琳.用PCR 方法對布魯氏菌進(jìn)行篩查及分型鑒定的研究［J］.中國地方病防治雜志，2009，24(6):300.

［4］ 張芳，錢愛東.布魯氏菌診斷學(xué)研究進(jìn)展［J］.吉林畜牧，2011，01，274(32):10.

［5］ 姜海，崔步云，AMOS-PCR 對布魯氏菌種型鑒定的應(yīng)用［J］.中國人獸共患病學(xué)報，2009，(25):107.

［6］ XinghongYANG，Jerod A .SKYBERG，LingCAO.Progress in Brucella vaccine development［J］.Front Biol (Beijing).2013，8(1):60 -77.