橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分的觸角電位反應(yīng)

杜迎剛, 季清娥, 陳家驊, 賴鐘雄

(1.濰坊科技學(xué)院生物工程研發(fā)中心，山東 壽光 262700；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

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橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分的觸角電位反應(yīng)

杜迎剛1,2, 季清娥3, 陳家驊3, 賴鐘雄2

(1.濰坊科技學(xué)院生物工程研發(fā)中心，山東 壽光 262700；2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002)

采用觸角電位技術(shù)系統(tǒng)測(cè)試了橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分的反應(yīng).結(jié)果表明：在啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分中，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯是對(duì)橘小實(shí)蠅起引誘作用的主要物質(zhì)，其對(duì)橘小實(shí)蠅激發(fā)的觸角電位相對(duì)值均超過(guò)了參照正己醇.當(dāng)v樣品∶v石蠟=1∶100時(shí)，乙酸苯乙酯對(duì)雌性橘小實(shí)蠅激發(fā)的觸角電位相對(duì)值和3-甲基-1-丁醇對(duì)雄性橘小實(shí)蠅激發(fā)的觸角電位相對(duì)值與正己醇相比差異顯著；苯甲醛對(duì)雄性橘小實(shí)蠅激發(fā)的觸角電位相對(duì)值達(dá)1.7895，與正己醇相比差異極顯著.當(dāng)v樣品∶v石蠟=1∶10時(shí)，對(duì)雌性橘小實(shí)蠅而言，苯甲醛、乙酸苯乙酯激發(fā)的觸角電位相對(duì)值與正己醇差異顯著，3-甲基-1-丁醇激發(fā)的觸角電位相對(duì)值與正己醇差異極顯著；對(duì)雄性橘小實(shí)蠅而言，苯甲醛、乙酸苯乙酯激發(fā)的觸角電位相對(duì)值與正己醇差異顯著，3-甲基-1-丁醇、乙酸辛酯激發(fā)的觸角電位相對(duì)值與正己醇相比差異極顯著.

觸角電位; 啤酒廢酵母; 酶解揮發(fā)物; 橘小實(shí)蠅

橘小實(shí)蠅[Bactroceradorsalis(Hendel)]為害46科250多種果樹、花卉和蔬菜.近十多年來(lái)，其給我國(guó)福建、廣東、廣西、海南、湖南、云南、四川、貴州等省區(qū)的果蔬造成嚴(yán)重危害[1-2].基于實(shí)蠅綜合治理經(jīng)驗(yàn)的積累和對(duì)國(guó)外實(shí)蠅防治成功案例的分析[3-4]，人們對(duì)實(shí)蠅蛋白誘殺防治重要性的認(rèn)識(shí)越來(lái)越清晰，逐漸開展了實(shí)蠅蛋白誘劑制備及其成分分析方面的研究[1，5].但有關(guān)蛋白誘劑中對(duì)實(shí)蠅起引誘活性的物質(zhì)卻鮮見(jiàn)報(bào)道.

觸角電位(electroantennogram，EAG)技術(shù)是測(cè)定昆蟲對(duì)次生揮發(fā)物生理反應(yīng)的一種重要方法[6].蛋白誘劑對(duì)實(shí)蠅的吸引與蛋白材料水解或發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性成分有關(guān)[7].為明確具體的引誘活性成分，進(jìn)一步了解此類蛋白的引誘機(jī)理，本研究將系統(tǒng)測(cè)定橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分中已鑒定的15種物質(zhì)[8-9]的觸角電位反應(yīng)，為實(shí)蠅引誘物質(zhì)的開發(fā)和引誘蛋白的人工配制提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

橘小實(shí)蠅為福建農(nóng)林大學(xué)益蟲研究所2002年建立的室內(nèi)種群，在其產(chǎn)卵盛期(羽化后10-14 d)采卵，人工飼料飼養(yǎng)，收集發(fā)育較一致的老熟幼蟲讓其在沙中化蛹，取上午7：00-9：00羽化的2-6日齡成蟲作為本試驗(yàn)用蟲.

養(yǎng)蟲籠：28 cm×28 cm×28 cm塑料骨架加100目尼龍網(wǎng).飼養(yǎng)條件：溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度為75%±5%，光照L∶D=12∶12(光期7:00-19:00).

1.2 儀器和試劑

觸角電位儀：荷蘭Syntech公司，包括毛細(xì)管電極、Syntech MP 15微動(dòng)操作儀、Syntech UN-06直流交流放大器和Syntech CS-05刺激氣流控制裝置.

試劑：3-甲基-1-丁醇(3-methyl-1-butanol)純度99.6%，正己酸(hexanoic acid)純度99%，壬酸乙酯(nonanoic acid-ethyl ester)純度99%，甲氧基乙醇(ethyleneglycol-monomethyl ether)純度99.8%，均為德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；十二烷酸乙酯(ethyl laurate)、癸酸乙酯(ethyl caprate)、辛酸乙酯(ethyl caprylate)、苯乙腈(benzyl cyanide)均為標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)AccuStandard公司產(chǎn)品；正辛酸(n-octanoic acid)純度99%，乙酸辛酯(octyl acetate)純度99%，苯乙醇(phenethyl alcohol)純度99%，苯甲醛(benzaldehyde)純度99.7%，乙醇(ethanol)純度100%，均為北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；乙酸苯乙酯(2-phenylethyl acetate)純度98%，為東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品；丙酮(acetone)純度99.8%，阿拉丁試劑(上海)有限公司產(chǎn)品；正己醇(hexyl alcohol)純度97%，為美國(guó)Fluka公司產(chǎn)品；石蠟油純度100%，為比利時(shí)Acros Organics公司產(chǎn)品.

1.3 觸角電位測(cè)定方法

參照田厚軍等[10]和Douglas et al[11]的方法，取用石蠟油配制的樣品20 μL均勻滴于長(zhǎng)約4 cm、寬0.5 cm的三角形濾紙片上，放入巴斯德管中，使管大口端連接刺激氣流控制裝置，送氣管出氣口與觸角相距約1 cm并縱向垂直.調(diào)整連續(xù)載氣流量為124 mL·min-1，刺激載體流量為20 mL·min-1，刺激時(shí)間為0.2 s，2次刺激之間隔50 s(以保證觸角感覺(jué)器官功能完全復(fù)原).同一處理在同根觸角上平行測(cè)試3次，每天每個(gè)處理各測(cè)試雌、雄橘小實(shí)蠅1根觸角，連續(xù)測(cè)試5 d.測(cè)試順序?yàn)閷?duì)照、參照、樣品(v樣品∶v石蠟為1∶100、1∶10)、對(duì)照.每種化合物的EAG相對(duì)反應(yīng)值根據(jù)下列公式計(jì)算.

EAG相對(duì)反應(yīng)值=(待測(cè)樣品的反應(yīng)值-對(duì)照前后2次的平均反應(yīng)值)/(參照的反應(yīng)值-對(duì)照前后2次的平均反應(yīng)值)×100%

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

用Excel 2007和SPSS 19.0 for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因子方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用Duncan′s新復(fù)極差法分析EAG反應(yīng)值的差異顯著性.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)段的橘小實(shí)蠅對(duì)苯甲醛的EAG相對(duì)反應(yīng)值

根據(jù)橘小實(shí)蠅對(duì)蛋白誘劑的反應(yīng)存在時(shí)辰和日齡差異[12]，且實(shí)蠅氣味結(jié)合蛋白對(duì)酮類物質(zhì)具有強(qiáng)親和性[13]等報(bào)道，本研究以啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分中的醛類物質(zhì)——苯甲醛為刺激物對(duì)橘小實(shí)蠅的EAG進(jìn)行測(cè)定.從圖1可以看出，在2種試驗(yàn)濃度下，雌、雄橘小實(shí)蠅對(duì)苯甲醛的EAG相對(duì)反應(yīng)值均以12:00-13:00時(shí)段為底點(diǎn)，呈現(xiàn)有規(guī)律的雙峰變化，且上午時(shí)段的峰值高于下午時(shí)段.對(duì)于雄性橘小實(shí)蠅，雖然2個(gè)試驗(yàn)濃度下均以8:00-9:00、9:00-10:00、10:00-11:00 3個(gè)時(shí)段的EAG相對(duì)反應(yīng)值較高，但僅當(dāng)苯甲醛濃度為1∶10時(shí)，8:00-9:00與12:00-13:00的EAG相對(duì)反應(yīng)值存在顯著差異(P<0.05).對(duì)于雌性橘小實(shí)蠅，當(dāng)苯甲醛濃度為1∶100時(shí)，9:00-10:00、10:00-11:00、13:00-14:00 3個(gè)時(shí)段的EAG相對(duì)反應(yīng)值與11:00-12:00、12:00-13:00時(shí)段存在顯著差異(P<0.05)；當(dāng)苯甲醛濃度為1∶10時(shí)，7:00-8:00、9:00-10:00、10:00-11:00 3個(gè)時(shí)段的EAG相對(duì)反應(yīng)值顯著高于11:00-12:00、12:00-13:00時(shí)段(P<0.05)，同時(shí)，9:00-10:00、10:00-11:00 2個(gè)時(shí)段的EAG相對(duì)反應(yīng)值與14:00-15:00時(shí)段存在顯著差異(P<0.05).綜上所述，結(jié)合實(shí)蠅飼養(yǎng)的光周期及儀器的維護(hù)時(shí)間，確定系統(tǒng)測(cè)定橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分觸角電位反應(yīng)的時(shí)間為8:00-11:00.

圖中字母為Duncan′s多重比較結(jié)果，不同字母表示同一濃度同一性別在不同時(shí)段間的差異達(dá)到0.05顯著水平.

2.2 橘小實(shí)蠅對(duì)啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性物質(zhì)的EAG相對(duì)反應(yīng)值

從表1可以看出，啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分中的很多物質(zhì)都能激發(fā)橘小實(shí)蠅很強(qiáng)的EAG反應(yīng).其中，3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、苯乙醇、苯乙腈、辛酸乙酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值均超過(guò)了參照正己醇.對(duì)雌性橘小實(shí)蠅而言，當(dāng)測(cè)試樣品濃度為1∶100時(shí)，乙酸苯乙酯激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值高達(dá)1.4609，與參照相比差異顯著(P<0.05)；乙醇、甲氧基乙醇、壬酸乙酯、癸酸乙酯、十二烷酸乙酯激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值顯著低于參照(P<0.05).當(dāng)測(cè)試樣品濃度為1∶10時(shí)，苯甲醛、乙酸苯乙酯激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值與參照間存在顯著差異(P<0.05)，而3-甲基-1-丁醇激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值高達(dá)2.6756，與參照相比差異極顯著(P<0.01).對(duì)于雄性橘小實(shí)蠅，當(dāng)測(cè)試樣品濃度為1∶100時(shí)，3-甲基-1-丁醇激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值與參照間存在顯著差異(P<0.05)，苯甲醛激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值高達(dá)1.7895，與參照相比差異極顯著(P<0.01)，而乙醇激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值僅與對(duì)照石蠟相當(dāng)；當(dāng)測(cè)試樣品濃度為1∶10時(shí)，正己醇激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值與苯甲醛、乙酸苯乙酯差異顯著(P<0.05)，與3-甲基-1-丁醇、乙酸辛酯差異極顯著(P<0.01).此外，不同性別的橘小實(shí)蠅對(duì)同一物質(zhì)同一劑量的反應(yīng)也表現(xiàn)出一定差異，雌性橘小實(shí)蠅對(duì)丙酮的EAG相對(duì)反應(yīng)值高于雄性，且這種差異在低濃度時(shí)更大，該情況在高濃度的癸酸乙酯、辛酸乙酯上同樣存在，但對(duì)高濃度乙酸辛酯的EAG相對(duì)反應(yīng)值卻低于雄性.

3 小結(jié)與討論

啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性成分中的3-甲基-1-丁醇、苯甲醛、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯濃度為1∶100時(shí)對(duì)橘小實(shí)蠅激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值就已超過(guò)參照正己醇1∶10濃度時(shí)的EAG相對(duì)反應(yīng)值，而苯甲醛對(duì)雄性橘小實(shí)蠅激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值在此濃度下高達(dá)1.7895；苯乙腈激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值也遠(yuǎn)超過(guò)了同濃度的正己醇，其在收集的啤酒廢酵母揮發(fā)性成分中的相對(duì)含量達(dá)40%以上[8]；辛酸乙酯在1∶10濃度時(shí)能引發(fā)橘小實(shí)蠅特別是雌性很強(qiáng)的觸角電位反應(yīng)，其在收集的啤酒廢酵母揮發(fā)性成分中的相對(duì)含量達(dá)13%以上[8].這些可能是啤酒廢酵母酶解蛋白對(duì)本地橘小實(shí)蠅表現(xiàn)較強(qiáng)引誘活性[1]的物質(zhì)基礎(chǔ).在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，辛酸和己酸對(duì)實(shí)蠅激發(fā)的觸角電位反應(yīng)比對(duì)照石蠟弱或呈現(xiàn)相反的觸角電位反應(yīng)，說(shuō)明這2種酸對(duì)橘小實(shí)蠅有驅(qū)避活性[14].這與室內(nèi)這2種物質(zhì)單獨(dú)或與3-甲基-1-丁醇復(fù)配的引誘試驗(yàn)結(jié)果一致.此外，苯甲醛、乙酸辛酯、3-甲基-1-丁醇對(duì)雄蠅激發(fā)的EAG相對(duì)反應(yīng)值高于雌蠅，這可能是杜迎剛等[2]發(fā)現(xiàn)橘小實(shí)蠅雄性較雌性先發(fā)現(xiàn)蛋白源的原因.

表1 橘小實(shí)蠅對(duì)不同濃度啤酒廢酵母酶解液揮發(fā)性物質(zhì)的EAG相對(duì)反應(yīng)值1)

1)表中字母為Duncan′s多重比較結(jié)果，同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示同一性別對(duì)不同物質(zhì)反應(yīng)的差異達(dá)0.01、0.05顯著水平.

六碳直鏈醇類、醛類和乙酸酯類是植物葉片內(nèi)的亞油酸、亞麻酸氧化分解的產(chǎn)物，稱為“綠葉氣體”[15].因此，啤酒廢酵母蛋白誘劑中的乙酸苯乙酯、乙酸辛酯都屬于“綠葉氣體”，其低濃度能夠激發(fā)橘小實(shí)蠅很強(qiáng)的觸角電位反應(yīng)；橘小實(shí)蠅對(duì)3-甲基-1-丁醇具有較強(qiáng)的觸角電位反應(yīng)，而其存在于橘小實(shí)蠅嗜好的多種寄主如香蕉、絲瓜、苦瓜[16]中；苯甲醛能夠引發(fā)橘小實(shí)蠅很強(qiáng)的觸角電位反應(yīng)，其也存在于橘小實(shí)蠅多種嗜好寄主如柑橘、苦瓜[16]中.這些都說(shuō)明啤酒廢酵母蛋白誘劑對(duì)橘小實(shí)蠅的引誘機(jī)理與寄主植物對(duì)其引誘機(jī)理類似.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Electroantennograhic responses of oriental fruit fly,Bactroceradorsalis(Hendel),to volatile enzymatic hydrolysate from spent brewer′s yeast

DU Ying-gang1,2, JI Qing-e3, CHEN Jia-hua3, LAI Zhong-xiong2

(1.Biological Engineering Research and Development Center, Weifang University of Science and Technology,Shouguang, Shandong 262700, China; 2.College of Horticulture; 3.College of Plant Protection,Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Electroantennogram (EAG) was employed to record the electrophysiological responses ofBactroceradorsalis(Hendel) to the volatile enzymatic hydrolysate from spent brewer′s yeast. The results showed that 3-methyl-1-butanol, benzaldehyde, benzyl cyanide, ethyl caprylate, octyl acetate, phenethyl acetate could evoke higher relative EAG values than hexanol, the reference. When the concentration of the sample and paraffin was 1∶100 (v∶v), the relative EAG values of phenylethyl acetate to females and 3-methyl-1-butyl to males showed significant differences compared with hexanol. The relative EAG value of benzaldehyde to male was 1.7895 and showed extremely significant difference compared with hexanol. When the concentration was 1∶10 (v∶v), for females, the relative EAG values of benzaldehyde and phenylethyl acetate showed significant differences, and that of 3-methyl-1-butyl showed extremely significant difference compared with hexanol. For males, the relative EAG values of benzaldehyde, phenyl ethyl acetate showed significant differences, and that of 3-methyl-1-butyl and octyl acetate showed extremely significant differences compared with hexanol.

electroantennogram (EAG); spent brewer′s yeast; volatile enzymatic hydrolysate;Bactroceradorsalis

2014-11-25

2015-02-27

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2011CQ002);濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GX043);國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2014GA740109).

杜迎剛(1977-),男,副教授.研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治.通迅作者賴鐘雄(1966-),男,研究員，博士生導(dǎo)師.研究方向：園藝植物生物技術(shù).Email：22246344@qq.com.

S475.1

A

1671-5470(2015)04-0355-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.004