SSR分子標(biāo)記在花生雜種鑒定中的應(yīng)用

王 輝, KHERA Pawan, 李雙鈴, 任 艷, 袁 美, 莊偉建, VARSHNEY Rajeev K, 郭寶珠, 謝聯(lián)輝

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002； 2.Department of Plant Pathology, University of Georgia,Tifton, GA 31793, USA; 3.International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, Patancheru, Andhra Pradesh 502324, India; 4.山東省花生研究所，山東 青島 266100; 5.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002； 6.Crop Protection and Management Research Unit, USDA-ARS, Tifton, GA 31793, USA)

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SSR分子標(biāo)記在花生雜種鑒定中的應(yīng)用

王 輝1,2, KHERA Pawan2,3, 李雙鈴4, 任 艷4, 袁 美4, 莊偉建5, VARSHNEY Rajeev K3, 郭寶珠6, 謝聯(lián)輝1

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建 福州 350002； 2.Department of Plant Pathology, University of Georgia,Tifton, GA 31793, USA; 3.International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, Patancheru, Andhra Pradesh 502324, India; 4.山東省花生研究所，山東 青島 266100; 5.福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，福建福州 350002； 6.Crop Protection and Management Research Unit, USDA-ARS, Tifton, GA 31793, USA)

以24份花生材料為親本，配制22個雜交組合，并利用40對SSR引物對24份親本材料進(jìn)行多態(tài)性篩選，運(yùn)用多態(tài)性引物鑒定92個F1代雜種的真?zhèn)?結(jié)果表明，不同組合親本間多態(tài)性差異較大，差異最大的兩親本(GT-C20-D和TamrunOL07)的多態(tài)性引物比例為65%.SSR標(biāo)記法鑒定出49個單株為真雜種；而田間表型鑒定出62個單株為真雜種，與標(biāo)記鑒定結(jié)果差異較大.本研究證實利用分子標(biāo)記鑒定真假雜種非常必要，且準(zhǔn)確可行.同時，本試驗證明40對SSR引物具有較高的多態(tài)性，可直接用于花生遺傳多樣性、雜種鑒定以及遺傳圖譜構(gòu)建等的研究.

花生; SSR; 雜種鑒定; 分子標(biāo)記

花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要經(jīng)濟(jì)與油料作物，其遺傳育種研究一直備受重視[1].花生屬嚴(yán)格的自花授粉作物，通過人工操作即可進(jìn)行雜交育種，但由于諸多不可控因素的影響，其自交產(chǎn)生假雜種的機(jī)率很高.及時準(zhǔn)確地鑒別雜交F1代的真假雜種，是雜交育種成功的關(guān)鍵.傳統(tǒng)真假雜種的鑒定主要通過觀察田間的表型性狀，但隨著花生育成品種間遺傳基礎(chǔ)的日益狹窄以及雜交親本間越來越小的形態(tài)表型差異，傳統(tǒng)方法鑒別雜種的難度增大.因此，發(fā)展高效和可靠的真假雜種鑒別方法十分必要.

分子標(biāo)記輔助育種(marker-assisted selection,MAS)，將現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，借助分子標(biāo)記對育種材料從DNA水平上進(jìn)行選擇，從而改良作物產(chǎn)量和品質(zhì)等性狀.同時，隨著各種標(biāo)記體系的建立，分子標(biāo)記被越來越多地應(yīng)用于現(xiàn)代作物遺傳育種研究的各個方面，并取得了很多成果[2-5].分子標(biāo)記用于雜種鑒定和純度估計性研究時具有周期短、不受環(huán)境條件影響、真實、準(zhǔn)確、可靠等優(yōu)點(diǎn).近年來很多研究表明，SSR標(biāo)記在花生栽培種間有較高的多態(tài)性，帶型穩(wěn)定，操作簡單，能檢測出微小的變異，是目前分析花生栽培種遺傳多樣性和鑒定花生雜種真?zhèn)蔚睦硐霕?biāo)記之一[6-9].因此，本研究選擇多態(tài)性較高的40對SSR引物對花生24份親本進(jìn)行多態(tài)性篩選，并運(yùn)用得到的多態(tài)性引物鑒定22個雜交組合的F1代雜種的真?zhèn)?，為花生雜交育種工作提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

以24份花生材料為親本(由美國佐治亞大學(xué)提供)，設(shè)計22個雜交組合，2013年夏季于佐治亞大學(xué)的溫室中進(jìn)行人工雜交，獲得22個組合的雜交F1代種子(表1).2014年5月將親本及收獲的F1代種子種植于佐治亞大學(xué)的實驗農(nóng)場.苗期剪取幼葉, 置于冰箱備用.在收獲前期根據(jù)親本和F1單株形態(tài)表型判斷真假雜種.

表1 供試材料和親本間的多態(tài)性引物以及雜種的分子標(biāo)記與表型鑒定結(jié)果

1.2 DNA提取與鑒定所用引物

DNA提取采用小量的CTAB法[10]，略做改良.通過1%瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量，并用 NanoDrop-1000分光光度計(Nano Drop Technologies, USA)測量濃度后，將所有DNA稀釋至25 ng·μL-1待用.雜種鑒定中，選用40對多態(tài)性高的花生栽培種基因組SSR引物(表2)，篩選親本DNA 多態(tài)性.這些引物均來自佐治亞大學(xué)實驗室，序列設(shè)計參照文獻(xiàn)[11-17].

1.3 SSR標(biāo)記分析

PCR反應(yīng)體系15 μL，包含10×PCR反應(yīng)緩沖液1.5 μL(含2.5 mmol·L-1MgCl2)、dNTPs(2.5 mmol·L-1)1.2 μL、正向和反向引物(5 μmol·L-1)各1.0 μL、Taq聚合酶(5 U·μL-1)0.2 μL、50 ng DNA.擴(kuò)增反應(yīng)在DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler(BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)和Eppendorf Mastercycler Pro(Eppendorf North America, USA)PCR儀上完成.SSR 擴(kuò)增反應(yīng)程序:95 ℃變性4 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物采用6.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳槽型號DYCZ-30(六一牌,北京),電泳緩沖液1×TBE,電壓140 V,時間2 h，0.1% AgNO3染色，BIORAD凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照.

表2 本研究所用40對SSR引物的信息

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交F1代田間表型鑒定

若父母親本形態(tài)表型差異大，其F1代真假雜種較易鑒別；若父母親本形態(tài)表型高度相似，F(xiàn)1后代雖有雜種優(yōu)勢，但根據(jù)形態(tài)表型仍無法完全鑒別其真?zhèn)?根據(jù)田間表型鑒定的結(jié)果見表1.

2.2 親本間的SSR標(biāo)記多態(tài)性

利用40對SSR引物檢測雜交親本的多態(tài)性，40對引物均獲得擴(kuò)增產(chǎn)物.每個組合中檢測出的多態(tài)性引物的數(shù)目和比例各不相同(表1).多態(tài)性引物數(shù)目最多的為“GT-C20-D×TamrunOL07”組合，有26對引物在兩親本中表現(xiàn)多態(tài)，多態(tài)性比例為65%;多態(tài)性比例超過50%的有8個組合，占所有組合的36.4%;僅有4對引物表現(xiàn)多態(tài)的組合有6個，占所有組合的27%.由引物IPAHM123和IPAHM23在24份親本中的擴(kuò)增圖譜(圖1)可以看出，前12個親本在這2個引物中的多態(tài)性較好，后12個親本在這2個引物中的差異較小，與表1結(jié)果一致.

M.Marker (100 bp DNA Ladder, Promega);1-24為24份親本，依次為B02、Z1216、A03、Z1235、A07、B01、PE2、GT-C20-D、

2.3 真假雜種分子鑒定結(jié)果

選擇擴(kuò)增帶型好，且表現(xiàn)為共顯性的引物進(jìn)行F1真假雜種的分子鑒定.每個組合至少選用2對引物，以確保鑒定的準(zhǔn)確性.以SSR引物擴(kuò)增F1單株，根據(jù)帶型鑒別雜種真?zhèn)?，其中表現(xiàn)父本帶型或同時出現(xiàn)父母本帶型的為真雜種，僅出現(xiàn)母本帶型的為偽雜種.由表1可以看出，共對92個F1單株進(jìn)行真假雜種鑒定，其中分子標(biāo)記鑒定的真雜種的單株數(shù)為49個，比例為53.3%；表型鑒定的真雜種數(shù)為62個.可見，分子標(biāo)記和表型鑒定的結(jié)果存在一定差異，僅有7個組合經(jīng)2種方法的鑒定結(jié)果完全一致.

由圖2可以看出，經(jīng)引物IPAHM123和IPAHM23擴(kuò)增，F(xiàn)1單株中1、2、5的帶型均與母本A07一致，因此可以判定其為假雜種；3、4、6、7、8的帶型均是父母親本的混合帶型，可以認(rèn)定為真雜種.而在圖3中，組合19(6B×6A)的4個F1單株在引物AHGS0266中表現(xiàn)為父本帶型，在引物AHGS0599中則是父母親本的混合帶型，也可以認(rèn)定為真雜種.

M.Marker (100 bp DNA Ladder, Promega)；♂.父本Z1235；♀.母本A07；1、2、5.帶型與母本一致，為假雜種；

M.Marker (100 bp DNA Ladder, Promega)；♀.母本6B；♂.父本6A； 1、2、3、4.帶型與父本一致或出現(xiàn)父母本雜合帶型，為真雜種

3 討論

SSR標(biāo)記可從DNA水平上鑒定雜種真?zhèn)?，具備周期短、重?fù)性高、不受時間和生長環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn).利用該方法輔助選擇雜種，可提高真雜種的選擇效率，有助于促進(jìn)育種進(jìn)程.另外，SSR標(biāo)記具備鑒定苗期真雜種的特點(diǎn), 所以利用SSR標(biāo)記輔助創(chuàng)建遺傳群體, 可以確保所創(chuàng)建群體遺傳來源的可靠性[18].本研究利用SSR標(biāo)記準(zhǔn)確鑒定出22個雜交組合的F1代雜種的真?zhèn)?，矯正了形態(tài)表型鑒定的誤差，為后續(xù)的育種工作奠定了基礎(chǔ).

用分子標(biāo)記進(jìn)行真假雜種鑒定時，親本間的多態(tài)性分析非常重要，找到差異明顯的多態(tài)性標(biāo)記是第一步.本研究根據(jù)2000多對SSR引物在多個群體中篩選的結(jié)果，選擇多態(tài)信息含量高的40對SSR引物，對所有組合的親本進(jìn)行了篩選.各個組合中的多態(tài)性引物數(shù)目各不相同，這在一定程度上反映了親本間遺傳差異的大小.其中，多態(tài)性引物比例最高的為65%；8個組合的多態(tài)性比例超過50%；在少數(shù)幾個組合中多態(tài)性比例為10%，可能是由于親本間的遺傳差異太小引起.因此，本研究選用的40對SSR引物具有較高的多態(tài)性，可以直接用于花生的遺傳多樣性、雜種鑒定以及遺傳圖譜的構(gòu)建等研究.

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(責(zé)任編輯:楊郁霞)

Application of SSR markers in peanut F1hybrid identification

WANG Hui1,2, KHERA Pawan2,3, LI Shuang-ling4, REN Yan4, YUAN Mei4, ZHUANG Wei-jian5,VARSHNEY Rajeev K3, GUO Bao-zhu6, XIE Lian-hui1

(1.College of Plant Protection, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2.Department of Plant Pathology, University of Georgia, Tifton, GA 31793, USA; 3.International Crops Research Institute for the Semi-Arid Tropics, Patancheru, Andhra Pradesh 502324, India; 4.Shandong Peanut Research Institute, Qingdao, Shandong 266100, China; 5.College of Crop Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002,China; 6.Crop Protection and Management Research Unit, USDA-ARS, Tifton, GA 31793, USA)

The objective of this study was to screen highly informative genic and genomic SSR markers and to identify true hybrids from 22 crosses between 24 parents. 24 diverse peanut parental lines were used to make hybrid combinations. There were a total of 92 F1seeds produced that were planted in the field for identification of true hybrids. The results showed that the traditional morphological method identified 62 "true" F1s and the molecular method identified 49 "true" F1s. The traditional morphologic method often resulted in false positive. In contrast, the molecular marker method gave accurate identification. Forty SSR markers showed highly polymorphic information content (PIC) among the parental lines. Among the cross combinations, "GT-C20-D×Tamrun OL07" had the highest polymorphism (65%). These SSR markers could be very useful not only for evaluating the genetic diversity of breeding materials, but also for selection of parental lines for genetic mapping population development.

peanut (ArachishypogaeaL.); SSR; hybrid identification; molecular marker

2014-12-11

2015-04-06

青島市科技計劃(14-2-4-12-jch)；國家863計劃(2013AA102602)；國家自然科學(xué)基金(31471533)；山東省農(nóng)業(yè)資源創(chuàng)新利用項目；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新重點(diǎn)項目(2014CXZ10-4).

王輝(1978-),女,助理研究員,博士研究生.研究方向：花生植物病理和遺傳育種.Email: huixu@uga.edu.通訊作者謝聯(lián)輝(1935-)，男，教授.研究方向：植物病毒學(xué).Email: fjxlh@126.com.

S336

A

1671-5470(2015)04-0350-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.04.003