以低濃度異甘草素為基質(zhì)的MALDI-TOF MS用于小分子的檢測研究

黃 良，楊洪梅,2，石 磊，劉淑瑩,2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；.中國核工業(yè)建設(shè)集團(tuán)公司，核建清潔能源有限公司，北京 100037)

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以低濃度異甘草素為基質(zhì)的MALDI-TOF MS用于小分子的檢測研究

黃 良1，楊洪梅1,2，石 磊3，劉淑瑩1,2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所，長春質(zhì)譜中心，吉林 長春 130022；.中國核工業(yè)建設(shè)集團(tuán)公司，核建清潔能源有限公司，北京 100037)

以低濃度異甘草素(ISL，0.05 mmol/L)為基質(zhì)，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對(duì)精氨酸、甘露醇和蘇氨酸-亮氨酸二肽等小分子物質(zhì)進(jìn)行分析檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以低濃度異甘草素作為MALDI-TOF MS分析小分子物質(zhì)的有機(jī)基質(zhì)，所獲得的斑點(diǎn)均勻性和重復(fù)性、耐鹽能力、分辨率等均顯著優(yōu)于常用基質(zhì)2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)。本實(shí)驗(yàn)可為有機(jī)基質(zhì)在小分子分析中的應(yīng)用開辟新的窗口。

異甘草素(ISL)；基質(zhì)；基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)；小分子物質(zhì)

基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)是一種軟電離技術(shù)，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量后傳遞給樣品分子，從而使樣品分子電離[1-2]。在飛行時(shí)間質(zhì)量分析器(TOF)中，離子在電場作用下加速通過飛行管道，待測離子的質(zhì)荷比(m/z)與離子的飛行時(shí)間成正比，因此可根據(jù)到達(dá)檢測器的飛行時(shí)間來測定離子的質(zhì)荷比[3]。基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)是由MALDI離子源和TOF兩部分組成，它克服了生物大分子電離困難的問題，為研究生物大分子物質(zhì)提供了一種簡單的方法。在生物大分子的研究中，常用的基質(zhì)有2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、2,4,6-三羥基苯乙酮(THAP)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、芥子酸(SA)等[4-6]，這些基質(zhì)在常用的激光波長(N2源，337 nm)下都有很好的吸收，并且能夠與樣品分子形成均勻的微晶固體，從而獲得比較理想的質(zhì)譜圖。由于基質(zhì)離子峰干擾太強(qiáng)等原因，以上的有機(jī)基質(zhì)不能用于小分子的MALDI-MS分析，這在一定程度上阻礙了MALDI-MS在小分子物質(zhì)分析研究中的應(yīng)用。因此，在過去的十幾年里，MALDI-MS主要應(yīng)用于大聚合物、生物大分子和一些熱不穩(wěn)定、易碎、不揮發(fā)性的化合物，如蛋白質(zhì)等的研究[7-9]。近年來，研究者付出了很多努力去消除基質(zhì)離子的干擾，如Dong等[10]采用石墨烯作為基質(zhì)分析小分子物質(zhì)；Xu等[11-12]采用碳納米管作為基質(zhì)用于MALDI-TOF MS對(duì)小分子

進(jìn)行了分析。這些無機(jī)材料作為基質(zhì)用于分析小分子物質(zhì)與常用的CHCA和THAP等有機(jī)材料相比有很大的突破，但關(guān)于有機(jī)化合物中能夠較理想的分析小分子物質(zhì)的報(bào)道仍然較少。

異甘草素(4,2′,4′-三羥基查耳酮，ISL)是一類具有查兒酮結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物，為黃色針狀結(jié)晶，難溶于水，可溶于極性小的溶劑，如乙醚、氯仿等。ISL主要存在于豆科植物甘草的根，鷹嘴豆(CicerarietinumL.)的幼苗、豆芽，紅芪(RadixHedysari)、黃芪(RachxAstragali)、滇黃精(Polygonatumkingianum)的根，串果藤(Sinofranchetiachinensis)、香殊蘭(Crinumbulbispermum)的球莖中，具有抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)咳祛痰、解痙、擴(kuò)血管、腦保護(hù)等多種藥理作用[13-14]，在337 nm有較強(qiáng)的吸收[15]。ISL、DHB和THAP的結(jié)構(gòu)示于圖1。

本工作擬用低濃度的ISL和傳統(tǒng)的DHB、THAP作為基質(zhì)，采用MALDI-TOF MS分析精氨酸、甘露醇和蘇氨酸-亮氨酸二肽等小分子物質(zhì)，旨在為有機(jī)基質(zhì)在小分子分析中的應(yīng)用開辟新的窗口。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

MALDI-TOF MS儀(Voyager DE-STR)：美國AB Sciex公司產(chǎn)品，配有N2激光器，激光波長337 nm；DHB、THAP、ISL、α-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、棉籽糖：美國Sigma公司產(chǎn)品；甘露醇、精氨酸、蘇氨酸-亮氨酸二肽：北京化工廠產(chǎn)品；乙腈、甲醇：均為色譜純，美國Fisher公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水(電阻率18.2 MΩ/cm)：由Milli-Q超純水機(jī)制備，美國Millipore公司產(chǎn)品。

圖1 ISL、DHB和THAP的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structures of ISL, DHB and THAP

1.2 MALDI基質(zhì)溶液和樣品的制備

1.2.1 基質(zhì)溶液的制備 THAP和DHB溶解在乙腈-水溶液中(1∶1，V/V)，濃度均為0.5 mmol/L；ISL溶解在甲醇中，其濃度為0.05 mmol/L。在MALDI分析前，所有被分析物均用去離子水溶解和稀釋。

1.2.2 樣品的制備 參照文獻(xiàn)[15]，采用dried-droplet法制備樣品。首先將0.5 μL的樣品溶液點(diǎn)在不銹鋼靶上，然后立即將0.5 μL的ISL基質(zhì)溶液滴到樣品上，于空氣中干燥，結(jié)晶后進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3 MALDI-TOF MS條件

正離子反射模式，加速電壓20 kV，延遲時(shí)間100 ns，激光頻率3 Hz。外標(biāo)法進(jìn)行校正，校正液包括棉籽糖(m/z527.158 26)和CHCA(m/z

190.050 4)。獲得的質(zhì)譜圖來源于50個(gè)激光點(diǎn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 重復(fù)性

作為一種適宜的基質(zhì)，能與樣品的混合物在樣品靶上形成均勻的斑點(diǎn)是獲得較好的點(diǎn)和點(diǎn)重現(xiàn)性的前提。在使用dried-droplet方法分析甘露醇時(shí)，樣品與DHB、THAP、ISL基質(zhì)形成的結(jié)晶層的形態(tài)學(xué)差異示于圖2。由圖2可見，DHB與樣品在點(diǎn)的邊緣形成了針狀結(jié)晶，THAP在樣品的表面形成了網(wǎng)狀結(jié)晶，而ISL與樣品形成了均勻的表面，沒有大的簇。以分析0.2 g/L精氨酸為例，ISL為基質(zhì)時(shí)所獲得的RSD值不超過10%，而THAP和DHB為基質(zhì)時(shí)所獲得的RSD值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于10%，這表明ISL能提供良好的點(diǎn)和點(diǎn)的重復(fù)性，可為進(jìn)一步的定量研究奠定基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)中，從30個(gè)不同位置獲得的離子峰的相對(duì)強(qiáng)度和平均標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)示于圖3。

圖2 2 mmol/L甘露醇與DHB(a)、THAP(b)和ISL(c)基質(zhì)點(diǎn)樣形成結(jié)晶后的照片F(xiàn)ig.2 Images of sample preparation using DHB (a), THAP (b) and ISL (c) as the matrices

注：右側(cè)白色、灰色和黑色棒狀圖分別代表使用ISL、DHB和THAP為基質(zhì)所獲得的RSD值圖3 使用ISL、DHB和THAP為基質(zhì)的30個(gè)不同激光照射點(diǎn)所獲得的歸一化的精氨酸[M+H]+離子強(qiáng)度Fig.3 Plot of normalized [M+H]+ ion intensities yielded from 30 different positions on a sample of arginine with ISL in comparison to traditional DHB matrix and THAP matrix

2.2 耐鹽和基體組分的能力

在低含量的鹽類或基體組分存在的條件下，一般有機(jī)基質(zhì)解吸/離子化的能力會(huì)大大降低，因此，有必要考察ISL作為基質(zhì)的耐鹽和基體組分的能力。在鹽存在的條件下，以0.05 mmol/L ISL為基質(zhì)的0.2 g/L精氨酸的MALDI質(zhì)譜圖示于圖4。其中，圖4a和圖4b分別為1 mol/L和2 mol/L氯化鈉存在下，以ISL為基質(zhì)的精氨酸的MALDI質(zhì)譜圖。由圖可見，雖然在高濃度氯化鈉的條件下，離子信號(hào)強(qiáng)度和S/N有所降低，但在2 mol/L氯化鈉存在下仍可以檢測到精氨酸。圖4c是以ISL為基質(zhì)，1 mol/L脲素存在下的精氨酸的MALDI質(zhì)譜圖，圖中獲得了較好的精氨酸離子信號(hào)。在2 mol/L脲素存在的條件下，盡管S/N明顯降低，但仍可以檢測到精氨酸，其質(zhì)譜圖示于圖4d。然而，當(dāng)使用相同濃度的DHB和THAP為基質(zhì)時(shí)，在1 mol/L 氯化鈉或脲素存在下觀察不到樣品信號(hào)。由以上結(jié)果可以推測，ISL基質(zhì)適用于高濃度鹽或高濃度基體實(shí)際樣品的分析。

注：a.1 mol/L氯化鈉；b.2 mol/L氯化鈉；c.1 mol/L脲素；d.2 mol/L脲素圖4 鹽存在下，以0.05 mmol/L ISL為基質(zhì)的0.2 g/L精氨酸的MALDI質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI mass spectra of 0.2 g/L arginine ([M+H]+，175 u) using 0.05 mmol/L ISL as matrix in the presence of saline material

2.3 低濃度的ISL、DHB和THAP作為基質(zhì)分析小分子物質(zhì)的結(jié)果比較

分別以0.05 mmol/L ISL、0.5 mmol/L DHB和0.5 mmol/L THAP為基質(zhì)分析精氨酸、甘露醇和蘇氨酸-亮氨酸二肽，結(jié)果示于圖5。對(duì)以這3種物質(zhì)為基質(zhì)所獲得的分辨率進(jìn)行了比較，結(jié)果列于表1。通過比較發(fā)現(xiàn)：以0.05 mmol/L的ISL為基質(zhì)分析小分子，可以獲得無干擾的質(zhì)譜圖；而以DHB和THAP為基質(zhì)時(shí)，干擾峰很多，對(duì)未知物而言，根本無法區(qū)分目標(biāo)化合物；表1中的數(shù)據(jù)表明，以ISL為基質(zhì)獲得的分辨率高于以DHB和THAP為基質(zhì)獲得的分辨率。因此，低濃度的ISL更適合作為分析小分子的基質(zhì)。

表1 以ISL、DHB和THAP為基質(zhì)分析精氨酸、甘露醇和蘇氨酸-亮氨酸二肽所獲得的分辨率

注：a.精氨酸，DHB基質(zhì)；b.精氨酸，THAP基質(zhì)；c.精氨酸，ISL基質(zhì)；d.甘露醇，DHB基質(zhì)； e.甘露醇，THAP基質(zhì)；f.甘露醇，ISL基質(zhì)；g.蘇氨酸-亮氨酸二肽，DHB基質(zhì)； h.蘇氨酸-亮氨酸二肽，THAP基質(zhì)；i.蘇氨酸-亮氨酸二肽，ISL基質(zhì)圖5 使用3種不同基質(zhì)分析3個(gè)物質(zhì)所獲得的MALDI質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI mass spectra of 0.2 g/L arginine, 2 mmol/L mannitol, and 1 g/L Thr-Leu using DHB, THAP and ISL as matrices

3 結(jié)論

本工作采用低濃度的異甘草素(ISL，0.05 mmol/L)作為MALDI-TOF MS分析小分子物質(zhì)的基質(zhì)，對(duì)精氨酸、甘露醇和蘇氨酸-亮氨酸二肽等小分子物質(zhì)進(jìn)行分析，并與常用的有機(jī)基質(zhì)DHB和THAP比較。結(jié)果表明，ISL作為MALDI-TOF MS分析小分子物質(zhì)的基質(zhì)具有點(diǎn)和點(diǎn)的重復(fù)性好、耐鹽性好、無基質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)，這可為有機(jī)基質(zhì)在小分子的MALDI-TOF MS分析中的應(yīng)用開辟新的窗口。

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Low Concentration of Isoliquirigenin as a Matrix for the Analysis of Small Molecules by MALDI-TOF MS

HUANG Liang1, YANG Hong-mei1,2, SHI Lei3, LIU Shu-ying1,2

(1.JilinGinsengAcademy,ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China;2.ChangchunCenterofMassSpectrometry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciences,Changchun130022,China;3.ChinaNuclearEngineeringGroupCo.Ltd.,Beijing100037,China)

Small molecules, including arginine, mannitol and dipeptide were analyzed by matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) using a low concentration of isoliquirigenin (ISL, 0.05 mmol/L) as a matrix. In comparison with 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) and 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP), ISL exhibited outstanding matrix properties as follows: 1) higher homogeneity of crystallization thus allowing automatic data acquisition; 2) better spectral quality in terms of resolution and signal to noise ratio (S/N); 3) better salt tolerance. The study has an important role in organic compounds as matrix for analyzing small molecules, and can open up a new prospect.

isoliquirigenin (ISL); matrix; matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS); small molecules

2014-05-07;

2014-11-13

國家自然科學(xué)青年基金(21305135、21175127)資助

黃 良(1989—)，女(漢族)，江西人，碩士研究生，從事中藥化學(xué)研究。E-mail: huangliang0827@163.com

楊洪梅(1980—)，女(漢族)，黑龍江人，副研究員，從事生物質(zhì)譜研究。E-mail: yanghm0327@sina.cn 劉淑瑩(1943—)，女(漢族)，黑龍江人，研究員，從事中藥化學(xué)和有機(jī)質(zhì)譜學(xué)研究。E-mail: liusy01@ccucm.edu.cn

O657.63

A

1004-2997(2015)03-0243-06

10.7538/zpxb.2015.36.03.0243