雞pIgR多克隆抗體的制備及初步鑒定

李德軍，劉運(yùn)楓，宋 雪，任利敏

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

雞pIgR多克隆抗體的制備及初步鑒定

李德軍，劉運(yùn)楓，宋 雪，任利敏

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030）

根據(jù)GenBank中雞pIgR基因序列和蛋白序列，設(shè)計(jì)引物，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增胞外配體結(jié)合區(qū)片段，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）/pIgR，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，通過(guò)鎳離子螯合柱純化后免疫新西蘭大白兔，獲得兔抗雞pIgR多克隆抗體，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA法）和Western Blot法檢測(cè)抗體的效價(jià)和特異性。結(jié)果顯示，成功制備特異性的雞pIgR抗體，為研究雞pIgR的功能提供有力依據(jù)。

雞；pIgR；多克隆抗體

大多數(shù)病原體，尤其是通過(guò)黏膜侵入機(jī)體的病原對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大損失。所以，對(duì)禽類(lèi)消化和呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防，日益受到人們的重視。有研究表明，機(jī)體95%以上的感染發(fā)生在黏膜或由黏膜入侵機(jī)體［1］。而黏膜免疫主要是靠分泌型免疫球蛋白（SIgA）發(fā)揮作用。

SIgA不僅是抵抗環(huán)境中病原體入侵黏膜表面的第一道特異性免疫防線，還可以平衡體內(nèi)共生的微生物群［2］。研究表明，SIgA的有效分泌依賴(lài)于pIgR（polymeric immunoglobulin receptor）的穿胞轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制［3］。pIgR屬于I型跨膜糖蛋白，分子量大小約為120 kDa［4］，它能夠與多聚免疫球蛋A（pI?gA）和多聚免疫球蛋白M（pIgM）特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)穿胞轉(zhuǎn)運(yùn)作用，將它們從上皮細(xì)胞基底側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到頂膜，并最終分泌到外分泌液中去，同時(shí)，釋放出與pIgA/pIgM相結(jié)合的分泌成分（SC），從而形成分泌型IgA（即SIgA）。因此，pIgR不僅是pI?gA/pIgM的轉(zhuǎn)運(yùn)受體，同時(shí)也是SIgA的重要組成部分［5-6］。因而pIgR的有效分泌是多聚免疫球蛋白發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件［7-10］，其在黏膜免疫中發(fā)揮著重要作用。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株及試驗(yàn)動(dòng)物原核表達(dá)載體pET-32a（+），大腸桿菌感受態(tài)DH5、BL21（DE3）均由本試驗(yàn)室保存；21日齡SPF雞與新西蘭雄性大白兔，購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 主要試劑TRIZol、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，購(gòu)自上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司；500 bpDNA Ladder（Dye Plus）、Taq DNA聚合酶，PCRBuffer、dNTP（2.5mmol/L），限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Xho I，T4 DNA連接酶，氨芐青霉素，IPTG和DAB顯色液，購(gòu)自大連TaKaRa生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒小提及膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司；DNA Marker（DL-2 000）、Protein Marker（14～100 kDa/15～100 kDa），購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；辣根酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 雞PIGR胞外段cDNA的擴(kuò)增根據(jù)NCBI上收錄的雞pIgR基因核苷酸序列，確定其胞外段基因序列，設(shè)計(jì)引物，并在上游F和下游R中引入限制性?xún)?nèi)切酶BamH I、Xho I的酶切位點(diǎn)。F：5′-CG GGATCC CCTCCCACCACGGTGAACA-3′；R：5′-CC CTCGAG GCCGTTCTTTGGGTTGTCAATGA-3′預(yù)測(cè)片段大小為801 bp，引物由上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司合成。TRIZol法提取雞空腸組織內(nèi)總RNA，用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成cD?NA。利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為T(mén)aq DNA聚合酶1μL，PCR Buffer 2.5μL，dNTP（2.5 mmol/L）2μL，上下游引物各1μL，cDNA模板2μL，RNase free ddH2O補(bǔ)至20μL。反應(yīng)體系為95℃5min，95℃30 s，58℃30 s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收目的片段，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 pET-32a（+）/pIgR重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選及鑒定將純化后的PCR產(chǎn)物和pET-32a（+）質(zhì)粒分別用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Xho I進(jìn)行雙酶切，建立以下20μL雙酶切體系：水2μL，10 K Buffer 2μL，純化后PCR產(chǎn)物（pET-32a（+）質(zhì)粒）14μL，BamH I和Xho I各1μL，37℃水浴3 h。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，膠回收目的片段，-20℃保存?zhèn)溆?。取雙酶切并純化后的PCR產(chǎn)物及pET-32a（+）線性載體，建立以下10μL的連接反應(yīng)體系：T4連接酶1μL，10×T4 Buffer 1μl，雙酶切的PCR產(chǎn)物6μL，雙酶切的pET-32a（+）線性載體2μL，16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α上，涂板培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR和酶切鑒定。鑒定陽(yáng)性菌液送至上海Invitrogen生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 PIGR原核蛋白表達(dá)及收集將雙酶切及測(cè)序鑒定正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)記為pET-32a（+）/pIgR，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）上，挑取單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接于20mL含有1μL/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下以200 r/min的速度于全溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。過(guò)夜培養(yǎng)菌液以1∶100的比例接種到含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃條件下以200 r/min的速度振蕩培養(yǎng)2.5 h后，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，37℃繼續(xù)通氣培養(yǎng)6 h，收集菌液，冰上超聲破碎，工作15 s，暫停10 s，重復(fù)100次。12 000 r/min（4℃）離心15 min，收集不溶組分。將不溶組分用尿素處理，經(jīng)鎳離子螯合柱純化后，收集蛋白。

1.6 兔抗雞pIgR抗血清的制備將純化后的融合蛋白與弗氏完全佐劑1∶1后，通過(guò)皮下多點(diǎn)注射免疫試驗(yàn)兔，初疫十天后，每周對(duì)試驗(yàn)兔用不完全佐劑抗原蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫四次后，對(duì)兔子進(jìn)行心臟穿刺取血，約50mL，室溫靜置1 h后放入4℃冰箱中，靜置過(guò)夜待血清充分析出，取血清用0.22μm孔徑微孔濾膜過(guò)濾后，-20℃保存?zhèn)溆?。用瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)抗血清效價(jià)。

1.7 Western Blot檢測(cè)pIgR多抗特異性將誘導(dǎo)0 h和4 h的菌體全蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂乳37℃封閉1 h；加入兔抗雞pIgR抗血清（1∶1 000倍稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h；二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000倍稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h；TBST洗膜3次后，用DAB顯色液顯色，待陽(yáng)性條帶出現(xiàn)后滴加去離子水終止反應(yīng)。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 雞pIgR胞外段的克隆圖1可見(jiàn)，PCR反應(yīng)擴(kuò)增的pIgR片段大小位于750 bp和1 000 bp之間，且條帶單一，與預(yù)測(cè)的片段大小相一致，可以切膠回收，用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 pIgR片段的PCR擴(kuò)增電泳

2.2 pET-32a（+）/pIgR質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.2.1 pET-32a（+）空載體與pIgR片段的雙酶切結(jié)果圖2可見(jiàn)，pET-32a（+）質(zhì)粒和pIgR片段經(jīng)過(guò)BamH I、Xho I雙酶切后的條帶比較清晰，可以進(jìn)行膠回收。

圖2 pET-32a（+）空載體與pIgR片段經(jīng)雙酶切后的電泳

2.2.2 pET-32a（+）/pIgR質(zhì)粒的雙酶切結(jié)果如圖3所示，陽(yáng)性重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I、Xho I雙酶切后，得到了兩條DNA片段，小片段與插入的雙酶切的pIgR片段大小一致，說(shuō)明pIgR片段已經(jīng)正確插入到原核表達(dá)載體中。

圖3 pET-32a（+）/pIgR重組質(zhì)粒和pIgR片段經(jīng)雙酶切后的電泳檢測(cè)

2.3 pIgR原核蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將鑒定陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pET-32a（+）/pIgR轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）表達(dá)菌上，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，取不同時(shí)間段菌體，處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，預(yù)期蛋白大小為48 kD左右，如圖4所示，pIgR原核表達(dá)蛋白位于40 kD與62 kD之間，符合預(yù)期蛋白大小。

2.4 兔抗雞pIgR抗血清的制備本次試驗(yàn)得到兔抗雞pIgR抗血清約10mL，經(jīng)瓊脂雙向擴(kuò)散試驗(yàn)測(cè)定該抗血清的效價(jià)為1∶51 200。如圖5所示，6 h表達(dá)菌中的pIgR蛋白能夠和兔抗雞pIgR抗血清進(jìn)行特異性反應(yīng)。

3 討論

圖4 原核重組蛋白電泳圖及表達(dá)量分析M：蛋白Marker；1：0 h表達(dá)菌；2：2 h表達(dá)菌；3：4 h表達(dá)菌；4：6 h表達(dá)菌

圖5 Western Blot DAB顯色結(jié)果

pIgR不僅可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多聚免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，還可以直接參與pIgA介導(dǎo)的保護(hù)機(jī)制。Mazanec M B等人的試驗(yàn)表明，pIgR除了在黏膜表面為機(jī)體提供SIgA，同時(shí)也是pIgA在組織和分泌型上皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮防御功能的必要條件［11］。近年來(lái)，與針對(duì)sIgA和pIgA/pIgM的研究相比，pIgR的相關(guān)研究還相對(duì)較少；與其相關(guān)的研究和報(bào)道多集中于哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)，而禽類(lèi)pIgR的克隆、表達(dá)及其相關(guān)研究報(bào)道也相對(duì)較少。

因此本試驗(yàn)利用pET-32a（+）原核表達(dá)載體對(duì)雞pIgR胞外配體結(jié)合區(qū)進(jìn)行克隆。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有高效、方便、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、可操作性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是獲取重組蛋白的重要表達(dá)系統(tǒng)［12］。pET-32a（+）原核表達(dá)載體使表達(dá)產(chǎn)物的氨基端帶His標(biāo)簽，可以利用鎳離子親和柱進(jìn)行蛋白純化，獲得高純度蛋白。在預(yù)試驗(yàn)階段，采用不同溫度培養(yǎng)條件（37℃、22℃和16℃）以及不同的濃度的IPTG（0.2mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L和1.5mmol/L）條件下進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)，通過(guò)對(duì)每一個(gè)條件組合下的表達(dá)量進(jìn)行分析，最終確定以37℃1 mmol/L IPTG為最佳誘導(dǎo)條件。試驗(yàn)結(jié)果顯示，此條件下蛋白表達(dá)量最大。通過(guò)ELISA和Western Blot檢測(cè)抗體的效價(jià)及特異性，結(jié)果顯示，該抗體具有較高效價(jià)，可以特異性識(shí)別pIgR蛋白。為進(jìn)一步探討pIgR的功能及深入了解pIgR在禽類(lèi)黏膜免疫防御中的作用機(jī)理奠定了分子基礎(chǔ)。

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Prelim inary identification and polyclonalantibody preparation of polymeric immunoglobulin receptor in chicken

LIDe-jun，LIU Yun-feng，SONG Xue，REN Li-min
（College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

A pair of primerswere designed clone the extracellular ligand binding area by RT-PCR on the basis of polymeric immunoglobulin receptor of chicken’s gene sequence and protein sequence from GenBank.The amplified segmentwas inserted to the expression plasmid pET-32a（+），and then the prokaryotic expression vector pET-32a（+）/pIgR was constructed.The plasmid was transformed into BL21（DE3）and induced by IPTG.The recombinant proteinswere purified by using Ni2+-NTA chelating col?umn.The purified proteinswere inoculated into New Zealand adult rabbits to developpolyclonal antibody against polymeric immu?noglobulin receptor of chicken.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）and Western blot were performed to evaluate the specificity of the prepared antibody.The results showed that the prokaryotic expression vector pET-32a（+）/pIgR was successfully constructed in this experiment.The polyclonal antibody of polymeric immunoglobulin receptor in chicken was generated and could be used to study the function of polymeric immunoglobulin receptor in chicken.

chicken；pIgR；polyclonal antibody

S858.31

A

0529-6005（2015）12-0013-03

2014-09-09

黑龍江省博士后啟動(dòng)金項(xiàng)目（LBH-Z11239）

李德軍（1974-），女，副教授，博士，主要從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控和新陳代謝疾病的研究，E-mail：ldjld j@163.com