豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒核酸擴增檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

高志強，劉 環(huán)，林祥超，張 偉，喬彩霞，谷 強，蒲 靜，張鶴曉

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

豬圓環(huán)病毒2型重組腺病毒核酸擴增檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制

高志強1，劉 環(huán)1，林祥超2，張 偉1，喬彩霞1，谷 強1，蒲 靜1，張鶴曉1

（1.北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島266109）

為研制用于豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）核酸擴增檢測（NAT）質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)樣品，本研究將豬圓環(huán)病毒2型QD/2014株ORF2連接到缺陷型腺病毒穿梭質(zhì)粒pacAd5 CMV K-NpA上，構(gòu)建了重組穿梭質(zhì)粒CMV-PCV-2-ORF2。將其與骨架質(zhì)粒pacAd5 9.2-100線性化后共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，經(jīng)胞內(nèi)重組獲得了內(nèi)含PCV-2-ORF2的重組腺病毒pacAd5 CMV-ORF2。采用PCR和基因測序方法對重組病毒鑒定后進行大量培養(yǎng)、分裝和凍干，經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性檢驗后對其進行了定值。結(jié)果表明，制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻、穩(wěn)定，PCV-2-ORF2基因含量為8.17×109GEq/mL，在HEK293細(xì)胞上的TCID50為3.56×107/0.05mL。本標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制成功為核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備開辟了一條新途徑。

豬圓環(huán)病毒2型；ORF2；重組腺病毒；標(biāo)準(zhǔn)樣品

豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）呈世界性分布，在家豬和野豬體內(nèi)均有發(fā)現(xiàn)。目前認(rèn)為PCV-2是一種重要的豬病病原，可引起豬的多種疾病，稱為PCV-2相關(guān)性疾病（PCV-2-associated diseases，PCVAD）。PCV-2感染可造成豬群免疫力下降，可導(dǎo)致多種疫苗免疫失敗，并導(dǎo)致豬只死亡率增加，因此對養(yǎng)豬業(yè)影響巨大［1］。

PCV-2基因組包括2個主要的ORF，其中ORF2不僅是其主要結(jié)構(gòu)蛋白基因，也是核酸擴增檢測的靶區(qū)域［2］。PCV-2感染的確診通常需要采用實驗室檢驗方法進行，一般需檢出病毒或其組分。由于核酸擴增檢測方法（NAT）的特異和高效，目前已經(jīng)成為PCV-2快速檢測的首選方法并得到廣泛應(yīng)用，但采用NAT方法一般均需使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)樣品來確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。高質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)具有無生物安全風(fēng)險，與被檢樣品狀態(tài)相近，可全程質(zhì)控、具有量值范圍和一定精密度的特性［3-4］。由于病原的繁殖涉及生物安全問題，近年來，核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)越來越受到國際認(rèn)可。目前動物疫病檢測核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有病原基因組核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和具有檢測意義的核酸片段標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，但制備這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最大難點是準(zhǔn)確定量問題。因此，探索能夠容易定量的核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)成為熱點。由于PCV-2在細(xì)胞上不導(dǎo)致病變，測定不致細(xì)胞病變的病毒TCID50較繁瑣且受人為因素影響較大，將不致細(xì)胞病變病毒的具有檢測意義的核酸片段重組到對人和動物無危害的病毒載體，重組病毒能夠?qū)μ囟?xì)胞產(chǎn)生致細(xì)胞病變作用，這樣對重組病毒的滴度測定可反映插入核酸片段的量。本研究首次以缺陷型人5型腺病毒為載體，將PCV-2 NAT檢測靶區(qū)域ORF2重組到病毒中，獲得重組腺病毒，在測得TCID50和其基因含量后，經(jīng)檢驗和定值后，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)用于檢測質(zhì)量控制，取得滿意效果。

1 材料與方法

1.2 豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因的擴增克隆以提取的PCV-2基因組DNA為模板，設(shè)計1對引物（序列見表1）經(jīng)PCR擴增PCV-2-ORF2基因。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物純化后克隆于pMD19-T，并進行鑒定。

1.3 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建使用Kpn I和Hind III對重組質(zhì)粒pMD19-T-ORF2和腺病毒穿梭載體pacAd5 CMV K-NpA雙酶切后，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建CMV-PCV-2-ORF2重組穿梭質(zhì)粒，并進行鑒定。1.4重組腺病毒在細(xì)胞HEK293T中的包裝與增殖

應(yīng)用Pac I對質(zhì)粒CMV-PCV-2-ORF2與pacAd5 9.2-100線性化，純化后共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞。同時，對質(zhì)粒CMV-GFP與pacAd5 9.2-100進行相同操作，作為轉(zhuǎn)染對照；正常的HEK293T作為細(xì)胞對照。當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)70%以上CPE，且轉(zhuǎn)染對照GFP出現(xiàn)大量熒光時，收集各組細(xì)胞。反復(fù)凍融3次后，于HEK293細(xì)胞中進行連續(xù)傳代，對第7代重組腺病毒進行鑒定。

1.5 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒的鑒定

將第7代pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2接毒細(xì)胞、轉(zhuǎn)染對照pacAd5 CMV-GFP接毒細(xì)胞以及正常HEK293細(xì)胞，離心取細(xì)胞沉淀后分別提取DNA和RNA。對于提取的RNA，利用DNAse I消化其中可能殘留的DNA。使用表1擴增引物分別進行PCR和RT-PCR鑒定，RT反應(yīng)條件為42℃60min，70℃15min，其他反應(yīng)條件同1.2。對擴增產(chǎn)物進行測序鑒定。

1.6 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒凍干將大量培養(yǎng)的第7代pacAd5 CMV-ORF2接毒細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，去除細(xì)胞碎片，按照1%加入海藻糖作為凍干保護劑，無菌條件下按照0.5mL/瓶分裝于西林瓶中，真空狀態(tài)下冷凍干燥24 h。

1.7 均勻性和穩(wěn)定性檢驗抽取10管凍干品，提取DNA并作103倍稀釋。應(yīng)用PCV-2熒光PCR方法在一次試驗中測試10份DNA樣品，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。采用最大二階導(dǎo)數(shù)法獲取Ct值；另對10管凍干品測定其TCID50，每個測2次。對獲得數(shù)據(jù)用單因子方差分析進行統(tǒng)計處理。

在以下每種條件下放置6瓶：（1）室溫20℃～25℃；（2）冷藏溫度2℃～8℃；（3）-20℃。定期取樣提取DNA作103倍稀釋后保存于-80℃。3個月后，應(yīng)用PCV-2熒光PCR方法在一次試驗中進行測試，采用最大二階導(dǎo)數(shù)法獲取Ct值；另測定凍干品的TCID50。對結(jié)果采用成對雙樣本均數(shù)-t檢驗進行統(tǒng)計分析。

PRB安裝在地下含水層當(dāng)中，與地下水流方向垂直，以保證污染羽與反應(yīng)介質(zhì)能充分反應(yīng)，當(dāng)污染地下水流經(jīng)PRB時，其中的污染物濃度能夠被降低.目前常見的PRB結(jié)構(gòu)類型有三種：連續(xù)墻式結(jié)構(gòu)、漏斗-導(dǎo)水門式結(jié)構(gòu)和灌注處理帶式結(jié)構(gòu)[22].其他結(jié)構(gòu)如墻簾式PRB[23]、微生物反應(yīng)墻[24]、虹吸式PRB[25]等都是在上述三種結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上優(yōu)化改進而來.

1.8 重組腺病毒的初步定值（GEq/mL和TCID50測定）

將純化的質(zhì)粒pMD19-T-ORF2，通過測定其260 nm的吸光度值，并推算拷貝數(shù)，系列稀釋后制成外標(biāo)品，應(yīng)用熒光PCR方法間接測定標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)。另外，取凍干品還原后，分別作10倍梯度稀釋（101～1012）測定其TCID50。

2 結(jié)果

2.1 PCV-2-ORF2基因PCR擴增結(jié)果以提取的PCV-2基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增獲得大小為702 bp的目的片段（見圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

表1 基因克隆及熒光PCR引物探針

圖1 ORF2基因擴增結(jié)果

2.2 重組腺病毒穿梭載體的構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒CMV-PCV-2-ORF2經(jīng)Hind III和Kpn I雙酶切后，得到大小為702 bp的目的片段，測序結(jié)果與已知序列一致。

2.3 重組腺病毒在細(xì)胞HEK293T中的包裝與增殖重組穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24 h后，對照轉(zhuǎn)染組可見少量熒光，10 d達峰；pacAd5 CMVORF2共轉(zhuǎn)染5 d后，細(xì)胞發(fā)生明顯細(xì)胞病變（CPE）；而正常HEK293T細(xì)胞不出現(xiàn)CPE（見中插彩版圖2）。

2.4 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒的鑒定結(jié)果結(jié)果顯示，只有pacAd5 CMV-PCV-2-ORF2感染細(xì)胞提取的DNA和RNA經(jīng)（RT-）PCR擴增均有約702 bp的擴增條帶，擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與預(yù)期一致。

2.5 含PCV-2-ORF2基因的重組腺病毒凍干以1%海藻糖作為凍干保護劑，真空狀態(tài)下冷凍干燥24 h得到了凍干品。

2.6 均勻性和穩(wěn)定性檢驗結(jié)果凍干品的均勻性檢驗結(jié)果經(jīng)單因子方差分析，結(jié)果顯示對于Ct值，F(xiàn)（20，9）=2.21，＜F0.05（2.39）；對于TCID50，值，F(xiàn)（10，9）= 1.75，＜F0.05（3.02）對于表明凍干品中被檢物是均勻的。

穩(wěn)定性檢驗數(shù)據(jù)經(jīng)成對雙樣本均數(shù)-t檢驗進行統(tǒng)計分析顯示，對于Ct值數(shù)據(jù)，t值分別為1.59和0.87；對于TCID50數(shù)據(jù)，t值分別為0.55和0.59。均＜t0.05（2.13）表明凍干后樣品穩(wěn)定性良好；Ct值和TCID50變化情況見圖3。

圖3 不同保存條件下穩(wěn)定性結(jié)果

2.7 重組腺病毒的初步定值結(jié)果（GEq/mL和TCID50測定結(jié)果）采用熒光定量PCR檢測，經(jīng)線性回歸，獲得標(biāo)準(zhǔn)樣品候選物PCV-2-ORF2基因含量為8.17×109GEq/mL。在HEK293細(xì)胞上的TCID50經(jīng)測定為3.56×107/0.05mL。

3 討論

目前，PCV-2是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原，據(jù)報道PCV-2感染可導(dǎo)致豬場豬只死亡率的增加從2%～3%到14%～30%不等［1］。因此，使用快速、靈敏的PCV-2病毒檢測方法用于養(yǎng)豬場疫情監(jiān)測非常重要?；贜AT檢測方法的特異、高效，目前已報道了很多基于NAT的PCV-2快速檢測方法［5-6］。NAT檢測方法屬于相對復(fù)雜的生物測定方法，對于同樣的樣品，由于DNA提取方法效率的不同，寡核苷酸引物、探針的效率不同都會給檢測結(jié)果帶來差異，甚至出現(xiàn)不同的結(jié)果，進而影響結(jié)果的判定。

為保證檢測質(zhì)量，評估不同NAT檢測方法效力和實驗室檢驗?zāi)芰?，研制均勻、穩(wěn)定，可進行量值傳遞的標(biāo)準(zhǔn)樣品用于PCV-2的檢測質(zhì)控非常必要。目前用于PCV-2 NAT檢測的質(zhì)控品為滅活病毒和質(zhì)粒DNA制備，或制備復(fù)雜需要生物安全設(shè)施，或雖制備簡單，但不能質(zhì)控DNA提取過程，而且易造成氣溶膠污染。均存在明顯不足之處，不能滿足實際需求。由于PCV-1和PCV-2基因序列最大的差異也位于ORF2基因內(nèi)，故目前檢測PCV-2的NAT方法均以O(shè)RF2作為靶標(biāo)進行設(shè)計［2］。腺病毒無囊膜，與PCV-2結(jié)構(gòu)大體類似，而且背景清楚，使用安全方便，因此本研究經(jīng)一系列試驗制備了PCV-2重組腺病毒核酸擴增檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品。

在腺病毒轉(zhuǎn)染與擴繁過程中發(fā)現(xiàn)，HEK293T的轉(zhuǎn)染效率高于HEK293，但HEK293T細(xì)胞用于繁殖病毒效價很低。故而在試驗中先使用HEK293T細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后再使用HEK293細(xì)胞進行病毒擴繁，取得滿意效果。均勻性和穩(wěn)定性試驗表明PCV-2重組腺病毒經(jīng)分裝凍干后，目標(biāo)成分均勻、穩(wěn)定。但標(biāo)準(zhǔn)樣品的GEq/mL和TCID50的精確量值還需進一步的協(xié)作標(biāo)定研究［3］。

綜上所述，本研究研制的PCV-2重組腺病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品符合臨床生物類標(biāo)準(zhǔn)樣品的基本要求-均勻、穩(wěn)定，與被測物品狀態(tài)相近且具有量值，可用于PCV-2 NAT測試中DNA提取、擴增等全過程的質(zhì)量控制，而且重組后的病毒能夠?qū)μ囟?xì)胞出現(xiàn)致細(xì)胞病變作用，也可以通過對重組病毒的滴度測定間接了解插入的核酸片段的量。本核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)推廣應(yīng)用后可促進PCV-2 NAT檢測方法的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化。

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Establishment of Recombinant Adenovirus as Referencematerial for Porcine Circovirus Type 2 Nucleic Acid Am plification Technology（NAT）-based Assays

GAO Zhi-qiang1，LIU Huan1，LIN Xiang-chao2，ZHANGWei1，QIAOCai-xia1，GUQiang1，PU Jing1，ZHANGHe-xiao1
（1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China；2.Animal scienceand Technology college，Qingdao Agricultural Vuiversity，Qingdao 266109，China）

Recombinant adenovirus containing PCV-2 ORF2 gene，whichmimics naturally DNA virus particles，can be used as candidate reference material for nucleic acid amplification technology（NAT）-based assays of PCV-2.In this paper，the com?plete ORF2 of PCV-2 stain QD/2014 was amplified and cloned to defective adenovirusshuttle plasmid pacAd5 CMV K-NpA to construct recombinant shuttle plasmid CMV-ORF2.When the linearized CMV-PCV2-ORF2 and backbone plasmid pacAd5 9.2-100 by Pac Iwere co-transfected into HEK293T cells，the adenovirus pacAd5 PCV-2 containing ORF2 were obtained by recombi?nation in vivo.Then the recombinant viruswhich was stable in propagation was verified by PCR and Sequencing.After propagation，aliquot，lyophilization，homogeneity and stability testing，the GEq/m l（gene equivalents/mL）and TCID50of the recombinant virus were determined.The result showed the prepared candidate referencematerial was homogeneous and stable with a value of 8.17× 109GEq/mL and 3.56×107/0.05mL（TCID50）.Based on the establishment of the PCV-2 candidate referencematerial，a new way for preparation of referencematerials for NAT-based assaywas developed.

Porcine circovirus type 2；ORF2；Recombinantadenovirus；Referencematerial

ZHANGHe-xiao

S852.65+1

A

0529-6005（2015）12-0010-03

2015-08-26

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項“動物疫病核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備關(guān)鍵技術(shù)研究”（201310253）

高志強（1974-），男，研究員，博士，主要從事動物檢驗檢疫研究，E-mail：gaozhiqiang02@163.com

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com