不同病理分級和臨床分期的腎癌組織中nucleostemin mRNA的表達

張 昊，徐衛(wèi)麗，武玉東，張 凱，岳俊敏，魏金星

1)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450007 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

不同病理分級和臨床分期的腎癌組織中nucleostemin mRNA的表達

張 昊1)△，徐衛(wèi)麗2)，武玉東2)，張 凱1)，岳俊敏1)，魏金星2)

1)鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450007 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州 450052

△男，1979年4月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：泌尿系腫瘤和微創(chuàng)泌尿外科，E-mail：jarrybird@126.com

nucleostemin基因；腎癌

Nucleostemin蛋白是定位在腫瘤細胞核和干細胞核內(nèi)的一種P53結(jié)合蛋白，可能負責(zé)對腫瘤細胞和干細胞的增殖進行相應(yīng)的調(diào)控，進而阻止其分化為成熟細胞并保持細胞的擴增狀態(tài)[1-3]。研究[4]發(fā)現(xiàn)nuleostemin基因在腎癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，而在正常腎組織中未發(fā)現(xiàn)其表達。作者采用RT-PCR法對不同臨床分期及不同病理分級的腎癌組織中nucleostemin mRNA的表達進行了檢測，進一步探討nucleostemin基因在腎癌進展中的意義。

1 材料與方法

1.1 標本 收集2003年11月至2006年1月鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科術(shù)中切除腎癌標本組織62例，均經(jīng)病理證實?；颊吣?5例，女27例，年齡29～78歲；透明細胞癌50例，顆粒細胞癌12例；按Thoenes病理分級，G1、G2、G3組織分別為13、27、22例；按Robson臨床分期，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期分別為17、22、18和5例。患者術(shù)前均未行免疫治療、化療、放療及腎動脈栓塞介入治療。新鮮切除標本手術(shù)臺邊放于EP管中，液氮浸泡10 min后，保存于-80 ℃冰箱中。

1.2 Nucleostemin mRNA的RT-PCR法檢測 取組織100 mg，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，進行PCR。Nucleostemin引物上游：5’-GGATCCATGAAAAGGCCTAAGTTAAAGAAAGC-3’，下游：5’-AAGCTTGCTCTCCAAATTCTCCTTTGGTA-3’;GAPDH引物上游：5’-GGTGGACCTGACCTGC CGTCTAGA-3’，下游：5’-TTACTCCTTGGAGGCCAT GTGGG-3’;引物均訂購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。擴增條件：94 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性, 64.5 ℃ 30 s退火, 72 ℃ 30 s延伸,循環(huán)38次。取產(chǎn)物10 μL加入6×Loading Dye 2 μL點樣，同樣點樣7 μL DNA Marker，90 V電壓下在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。以GAPDH為內(nèi)參照。ddH2O代替cDNA為陰性參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 10.0分析，不同病理分級和不同臨床分期腎癌組織中nucleostemin mRNA陽性率的比較采用χ2檢驗或精確概率法，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

圖1 腎癌組織中nucleostemin mRNA的表達

M：marker；N：陰性參照；1：GAPDH；2：nucleostemin cDNA片斷；3：腎癌組織中陰性表達，4～5、8～12：腎癌組織中陽性表達；6～7：正常腎組織。

2.2 不同臨床分期腎癌組織中nucleostemin mRNA的表達 Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期腎癌組織中nucleostemin mRNA陽性率分別為52.94%(9/17)、68.18%(15/22)、100%(23/23)，3者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Ⅲ～Ⅳ期組織陽性率明顯大于Ⅰ期組織(P<0.001)和Ⅱ期組織(P=0.004)。

3 討論

Nucleostemin基因在多種腫瘤細胞系，例如膀胱癌、前列腺癌、骨肉瘤、宮頸癌、肝癌、肺癌和胃癌細胞中以及一些干細胞中均有高水平的表達[5-8]，但在正常成人乳腺及腎臟細胞等已分化的細胞中未發(fā)現(xiàn)其表達，提示其在腫瘤細胞和干細胞這類增殖能力強的細胞中扮演著重要角色。Nucleostemin蛋白可能作為一種細胞周期檢測點調(diào)控因子特異性地調(diào)控腫瘤細胞和干細胞這類高增殖細胞的復(fù)制能力[9-10]。Nucleostemin蛋白可以與GTP分離或結(jié)合以改變其在核內(nèi)的活性，通過與P53蛋白分離或結(jié)合而改變細胞增殖、分化以及凋亡的過程。當(dāng)這種動態(tài)平衡被打破后，就可能導(dǎo)致細胞周期的紊亂和細胞內(nèi)環(huán)境的異常，進而引起腫瘤發(fā)生及腫瘤細胞的無序擴增發(fā)展。

既往研究[2]發(fā)現(xiàn)，在正常腎組織中未發(fā)現(xiàn)nucleostemin基因的表達；但nucleostemin基因穩(wěn)定的表達于不同病理組織類型的腎癌組織中，并有著非常高的陽性率，而在各個病理類型腎癌組織中的陽性率無明顯差異。Nucleostemin基因可能在腎癌細胞的增殖和自我更新中扮演重要的角色。 此次研究發(fā)現(xiàn)nucleostemin mRNA在腎癌組織中的表達隨著病理分級和臨床分期的增高而增加，中、晚期及低分化腎癌組織中的陽性率明顯高于高分化和早期腎癌組織。

在尚未分化的細胞中，Nucleostemin蛋白的N端結(jié)構(gòu)域與P53蛋白形成復(fù)合體，從而降低P53蛋白誘導(dǎo)細胞凋亡和調(diào)控細胞周期的功能，導(dǎo)致受損細胞的DNA無法修復(fù)，幫助細胞通過檢測點順利進入細胞周期，增加細胞癌變的機會。細胞進入分化期以后， nucleostemin基因在細胞的表達迅速下調(diào)，Nucleostemin蛋白與P53蛋白形成的復(fù)合體解離，釋放出P53蛋白重新調(diào)控細胞周期，而細胞分化成熟后，nucleostemin基因就停止了表達[1,7]。說明nucleostemin基因在分化差的細胞表達的更高，其基因表達和細胞分化情況有著緊密的聯(lián)系，所以其表達的強度可以作為評判腫瘤惡性程度的指標，這與該研究的結(jié)果相一致。通過改變nucleostemin的活性可能對腎癌起到一定的防治作用。

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(2014-08-22 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.035