KYBNZ-1I對(duì)Tca8113 細(xì)胞增殖的抑制作用

常 悅，王維嘉，樸軍顏，姚 珂，左非非，徐少博，徐 霞#

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

KYBNZ-1I對(duì)Tca8113 細(xì)胞增殖的抑制作用

常 悅1)，王維嘉2)，樸軍顏3)，姚 珂3)，左非非3)，徐少博3)，徐 霞3)#

1)鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院正畸科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系 鄭州 450001 3)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者，女，1965年4月生，博士研究生，教授，研究方向：藥物代謝，E-mail：xuxia@zzu.edu.cn

KYBNZ-1I；Tca8113細(xì)胞；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

目的：觀察冬凌草提取物KYBNZ-1I對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Tca8113增殖的抑制作用，并探討其可能機(jī)制。方法：采用MTT法檢測(cè)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I分別作用24、48、72 h對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用。分別采用流式細(xì)胞儀及Western blot檢測(cè)0.0、1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h Tca8113細(xì)胞的周期分布、凋亡情況及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖有抑制作用，該作用呈劑量和時(shí)間依賴性(F劑量=133.991，F(xiàn)時(shí)間=22.526，P<0.05)。與對(duì)照組比較，1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用48 h后G2/M期細(xì)胞增多，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，呈劑量依賴性(F=108.465、212.353，P<0.05)；隨藥物劑量的升高，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平下降(F=45.288，P<0.001)，CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達(dá)水平升高(F=21.273、19.228，P<0.05)。結(jié)論：KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖有抑制作用，可將細(xì)胞阻滯于G2/M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)、提高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。

口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤，其中口腔鱗狀細(xì)胞癌占口腔惡性腫瘤的80%以上，并且呈逐年增加的趨勢(shì)[1]。近年來癌癥的治療獲得了較大的進(jìn)步和發(fā)展，但死亡率仍呈上升趨勢(shì)。口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療一般以手術(shù)治療為主，放療、化療、免疫治療和中醫(yī)藥治療為輔。手術(shù)治療屬于損傷性治療，而放療和化療不僅殺傷腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞也有破壞作用。目前傳統(tǒng)的口腔鱗狀細(xì)胞癌化療藥物如順鉑、環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶等不良反應(yīng)重、耐藥廣泛，而且療效不太穩(wěn)定。因此，人們正在尋找既能使化療藥物發(fā)揮最大限度的殺傷作用又不損傷正常細(xì)胞的藥物[2-3]。冬凌草學(xué)名碎米椏，別名冰凌草，是一種多年生草本植物,主要產(chǎn)地為河南濟(jì)源太行山、王屋山一帶[4]。相關(guān)研究[5]表明冬凌草有抗腫瘤作用。KYBNZ-1I是新研制的一種冬凌草提取物的衍生物。作者觀察了KYBNZ-1I對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Tca8113的抑制作用，探討其遠(yuǎn)期用于口腔鱗狀細(xì)胞癌治療的可能性與安全性，以期為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療帶來新的契機(jī)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器 Tca8113 細(xì)胞株(Type Culture Collection，美國(guó))；KYBNZ-1I(鄭州大學(xué)藥學(xué)院)，胎牛血清(FBS)(北京索來寶有限公司)，胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(美國(guó)Sigma公司)，兔抗人細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、CyclinB1、Cdc-2、β-actin多克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，PBS粉末(鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司)，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(E191)(美國(guó)SIM公司)，超低溫冰箱(-80 ℃)(美國(guó)Thermo公司)，高速冷凍離心機(jī)(Z323K)(德國(guó)HERMLE公司)，96孔板(美國(guó)Corning Costar公司)，臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16G)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，蛋白電泳轉(zhuǎn)印儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將Tca8113細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,置37 ℃、濕度100%、體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每 1～2 d換液 1 次。

1.3 不同劑量KYBNZ-1I處理后細(xì)胞增殖抑制率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 5×104mL-1，接種于96孔板, 每孔200 μL。待細(xì)胞貼壁后分別加入終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液，設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，然后將培養(yǎng)板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。分別于藥物作用24、48、72 h后，加入5 g/L MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min使結(jié)晶充分溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的OD值，細(xì)胞增殖抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。采用改良寇氏法計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 不同劑量KYBNZ-1I處理后細(xì)胞周期的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Tca8113細(xì)胞，以終質(zhì)量濃度為1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I溶液和溶劑處理48 h；PBS洗滌2次，收集細(xì)胞，用體積分?jǐn)?shù)為70%的冷乙醇固定，4 ℃保存過夜；棄去乙醇，再次懸浮細(xì)胞于PBS，溴化丙啶染色5 min，4 ℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，得出細(xì)胞周期分布圖。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 不同劑量KYBNZ-1I處理后細(xì)胞凋亡的檢測(cè)

Tca8113細(xì)胞同1.4中分組、處理48 h后，用胰蛋白酶消化，收集106個(gè)細(xì)胞, PBS洗滌后加入500 mL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，每管加入 2 μL Annexin Ⅴ-FITC、2 μL PI雙染，室溫避光反應(yīng)10 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。采用5×3析因設(shè)計(jì)的方差分析觀察不同劑量KYBNZ-1I分別作用24、48和72 h對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響，采用單因素方差分析比較各組細(xì)胞周期分布、凋亡率及CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表達(dá)水平的差異，兩兩比較采用Bonferroni法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的影響 見表1。KYBNZ-1I處理Tca8113細(xì)胞24、48和72 h的IC50分別為5.137、4.254和6.384 mg/L。

表1 不同劑量KYBNZ-1I處理后Tca8113細(xì)胞的增殖抑制率 %

F時(shí)間=22.526，F(xiàn)劑量=133.991，F(xiàn)交互=8.083，P均<0.001。

2.2 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響 不同劑量的KYBNZ-1I作用48 h后, G0/G1期的Tca8113細(xì)胞減少，而G2/M期的Tca8113細(xì)胞增多。見表2。

表2 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞周期的影響 %

*:與0.0 mg/L組相比，P<0.05。

2.3 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示KYBNZ-1I可以促進(jìn)Tca8113 細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率隨給藥劑量的增大呈上升的趨勢(shì)(表3)，且晚期凋亡細(xì)胞增加尤為明顯。

2.4 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113 細(xì)胞CyclinD1、CyclinB1、Cdc-2蛋白表達(dá)水平的影響 隨著藥物劑量的增加，CyclinD1蛋白的表達(dá)水平逐漸下降，而CyclinB1、Cdc-2蛋白的表達(dá)水平逐漸升高，見表3。

表3 不同劑量KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞3種蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤之一，該類患者臨床上生存率較低， 且預(yù)后也較差。腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞增殖及凋亡失衡有關(guān)，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來消除腫瘤已成為治療腫瘤的有效途徑。冬凌草衍生物已被證實(shí)不僅具有抗腫瘤作用,還具有毒性低的特點(diǎn)[6]。 KYBNZ-1I是新研制的一種冬凌草衍生物。該研究顯示KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用隨藥物劑量的增大呈增強(qiáng)的趨勢(shì)，8.0 mg/L KYBNZ-1I作用72 h后，其增殖抑制率高達(dá)93.832%，產(chǎn)生此作用的原因可能是KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞產(chǎn)生了增殖抑制和分化誘導(dǎo)作用。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示KYBNZ-1I作用后，G0/G1期細(xì)胞比例降低，G2/M 期細(xì)胞比例增加，說明KYBNZ-1I可將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，可能通過促進(jìn)Tca8113 細(xì)胞DNA合成，阻止其分裂，從而抑制癌細(xì)胞的增殖活性；同時(shí)，細(xì)胞凋亡率也隨藥物劑量的增大而升高，說明KYBNZ-1I可能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

細(xì)胞周期的調(diào)控在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞周期調(diào)節(jié)依賴Cyclin、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)以及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。細(xì)胞周期中G1/S期轉(zhuǎn)換受到G1期Cyclin、CDK和CDK抑制劑的調(diào)節(jié)。細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制異常與細(xì)胞異常增殖及惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。人體細(xì)胞周期不同時(shí)相都存在關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)，正常情況下CyclinD1結(jié)合并激活G1期特有的 CDK4，使Rb蛋白磷酸化，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子 E2F，E2F 起始轉(zhuǎn)錄并激活細(xì)胞周期的相關(guān)基因，促使細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期[7]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究[8]證實(shí)CyclinD1和CDK4在正?？谇火つど掀そM織呈低水平表達(dá)，在口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中過表達(dá)，說明CyclinD1在惡性腫瘤的形成過程中起著十分重要的作用。該研究中以1.0、2.0、3.0 mg/L的KYBNZ-1I作用于Tca8113細(xì)胞48 h，結(jié)果顯示細(xì)胞CyclinD1蛋白的表達(dá)隨著藥物劑量增加而降低，推測(cè)KYBNZ-1I可能阻止Tca8113細(xì)胞由DNA合成前期向DNA合成期轉(zhuǎn)化，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

在細(xì)胞有絲分裂前，CyclinB1在細(xì)胞內(nèi)累積， CyclinB1結(jié)合Cdc-2形成CyclinB1-Cdc-2復(fù)合物，抑制Thr14和Tyr15磷酸化，Thr14和Tyr15磷酸化對(duì)有絲分裂起抑制作用[9]。有研究[10]表明CyclinB1一般在有絲分裂前期或中期積累，后期開始減少，在有絲分裂開始時(shí)進(jìn)入細(xì)胞核，從而促進(jìn)整個(gè)細(xì)胞周期過程。一般而言細(xì)胞阻滯于G2期，CyclinB1和Cdc-2活性減弱。該研究中KYBNZ-1I將Tca8113細(xì)胞阻滯于G2/M期，而CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達(dá)水平均隨著藥物劑量的增加而升高, 機(jī)制不詳，亦有學(xué)者[10]得出與該研究相似的研究結(jié)果，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，KYBNZ-1I對(duì)Tca8113細(xì)胞增殖有抑制作用,可將細(xì)胞阻滯于G2/M期，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與KYBNZ-1I抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)、升高CyclinB1和Cdc-2蛋白的表達(dá)有關(guān)。KYBNZ-1I的發(fā)現(xiàn)有望為口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療提供新的藥物。

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(2014-09-30 收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Inhibitive effect of KYBNZ-1I on proliferation of Tca8113 cells

CHANGYue1)，WANGWeijia2)，PIAOJunyan3)，YAOKe3)，ZUOFeifei3)，XUShaobo3)，XUXia3)

1)DepartmemtofOrthodontics,CollegeofStomatology,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)DepartmentofClinicalMedicine,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

KYBNZ-1I;Tca8113 cell;proliferation;apoptosis;cell cycle

Aim: To investigate the effect of KYBNZ-1I on proliferation of oral squamous cell carcinoma cell line Tca8113 and the possible mechanism.Methods: The effect of KYBNZ-1I(0.5,1.0,2.0,4.0 and 8.0 mg/L) on proliferation of Tca8113 cells for 24,48 and 72 h was measured by MTT assay. Tca8113 cells were treated by 0.0,1.0,2.0 and 3.0 mg/L KYBNZ-1I for 48 h, then flow cytometry and Western blot were used to detect the cell cycle distribution, apoptosis and the expressions of CyclinD1,CyclinB1 and Cdc-2.Results: KYBNZ-1I inhibited the proliferation of Tca8113 cells in a time and dose dependent manner(Fdose=133.991，F(xiàn)time=22.526，P<0.05). Compared with control group, the percentage of G2/M phase Tca8113 cells was significantly higher(F=108.465，P<0.001),and cell apoptosis rate raised(F=212.353，P<0.001) in a dose-dependent manner. With the increase of KYBNZ-1I concentration, the expression of CyclinD1 decreased(F=45.288，P<0.001),and the expressions of CyclinB1 and Cdc-2 increased(F=21.273 and 19.228，P<0.05).Conclusion: KYBNZ-1I could inhibit proliferation, arrest the cells at G2/M phase and induce cell apoptosis, which may be explained by its restraining expression of CyclinD1, and upregulating expressions of CyclinB1 and Cdc-2.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.028

R780.2