miRNA let-7b修飾的骨髓間充質干細胞移植對大鼠脊髓損傷后脊髓NF-200、GFAP表達的影響

徐玉生，崔 浩，張 松，王培松，朱海洋，鐘 斌，苗金紅

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

miRNA let-7b修飾的骨髓間充質干細胞移植對大鼠脊髓損傷后脊髓NF-200、GFAP表達的影響

徐玉生1)△，崔 浩1)，張 松1)，王培松1)，朱海洋1)，鐘 斌1)，苗金紅2)

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

△男，1969年3月生，博士，副主任醫(yī)師，副教授，研究方向：骨科疾病的基礎與臨床，E-mail：ysxu@zzu.edn.cn

miRNA let-7b；骨髓間充質干細胞；脊髓損傷；細胞移植；大鼠

目的：通過觀察miRNA let-7b修飾的骨髓間充質干細胞(BMSCs)移植對脊髓損傷大鼠的運動功能恢復的作用，探討miRNA let-7b在損傷脊髓修復中的作用和機制。方法：60只成年SD大鼠分為對照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。采用改良Allen′s法制備脊髓損傷模型。造模后1周， BMSCs組行BMSCs移植，miRNA組移植miRNA let-7b慢病毒載體感染的BMSCs，對照組注射生理鹽水。移植后第3天至8周，按BBB標準量表對大鼠后肢運動功能進行評分，用免疫組化方法檢測脊髓中神經絲蛋白-200(NF-200)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達。結果：實驗時間內，各組大鼠BBB評分和脊髓NF-200表達持續(xù)升高；不同時間點BBB評分和脊髓NF-200表達以miRNA組最高，BMSCs組次之，對照組最低(P<0.05)。移植后各組脊髓GFAP表達均呈持續(xù)性增高，各時間點GFAP陽性表達面積以對照組最大，BMSCs次之，miRNA組最小(P<0.05)。結論：miRNA let-7b可能通過促進BMSCs分化為神經元樣細胞、抑制脊髓損傷后反應性膠質細胞的增生及膠質瘢痕形成等機制促進損傷后的神經功能恢復。

脊髓損傷是一種嚴重的中樞神經系統(tǒng)疾病,常引起損傷節(jié)段以下肢體嚴重的功能障礙。隨著細胞技術的發(fā)展，外源性干細胞移植為脊髓損傷的治療提供了一種可能的方法。骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)有較強的自我更新和增殖能力，有望成為治療脊髓損傷的“種子細胞”[1]。但由于移植后的BMSCs在宿主體內成活率及轉化率較低，其應用受到很大的限制。 miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA分子，在生物體內廣泛存在，對真核生物的基因表達、細胞周期調控和個體發(fā)育等均有影響[2-6]。該實驗初步探討了miRNA let-7b修飾的BMSCs移植修復脊髓損傷的效果和可能機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 清潔級成年雌性SD大鼠60只，體重(230±20) g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。實驗前適應性飼養(yǎng)1周，自由飲食。采用隨機數字表法分為對照組、BMSCs組、miRNA組，每組20只。

1.2 主要試劑 miRNA let-7b慢病毒載體及陰性對照慢病毒載體由鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經內科賈延劼教授惠贈，神經絲蛋白-200(NF-200)抗體、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)兔抗大鼠多克隆抗體、SABC試劑盒、DAB試劑盒均購自北京博奧森有限公司。

1.3 脊髓損傷模型的建立 100 g/L的水合氯醛腹腔注射(300 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉成功后，大鼠取俯臥位固定于實驗臺上，術區(qū)備皮、消毒鋪巾后，取背部正中切口，以胸12為中心顯露硬膜，于其上放置一長方形塑料墊片(約4 mm×5 mm)，用改良Allen′s法[7-8]以5 g×10 cm的力度撞擊脊髓。造模后大鼠出現雙后肢回縮樣撲動、尾巴痙攣性擺動，局部脊髓充血水腫，BBB評分小于8分，即認為造模成功。生理鹽水沖洗后，再次消毒縫皮。術后1周內每天給予青霉素20萬U/kg腹腔注射，術后每天給予人工輔助排尿2次。

1.4 干預方法 取傳代5次以上的大鼠BMSCs，接種到24孔板上(細胞密度約2×106mL-1)培養(yǎng)48 h。將含miRNA let-7b的慢病毒載體上清加入培養(yǎng)基中，感染復數為20，置于培養(yǎng)箱中孵育。同法制備陰性對照慢病毒載體感染的BMSCs。造模成功后1周，BMSCs組在損傷部位注射10 μL陰性對照慢病毒載體感染的大鼠BMSCs(細胞懸液密度為107mL-1)，注射時進針方向與脊髓呈45°角，針頭指向損傷部位中央，進針深度約為2 mm。同法miRNA組在損傷部位注射10 μL miRNA let-7b慢病毒載體感染的大鼠BMSCs(細胞懸液密度為107mL-1)。對照組僅在損傷部位注射10 μL生理鹽水。

1.5 BBB法評估大鼠后肢運動功能的恢復情況 各組分別于細胞移植后第3天、1周、2周、4周、8周取4只大鼠，由兩人按照BBB評分標準量表進行評分。評分采用雙盲法，主要觀察大鼠的運動能力、運動協調性和軀體穩(wěn)定性。后肢無運動功能為0分，運動功能完全正常為21分。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0進行數據分析，3組間BBB評分、NF-200陽性細胞數及GFAP陽性表達面積的比較均采用析因設計的方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 實驗動物術后一般情況觀察 實驗過程中，對照組、BMSCs組各有1只大鼠因麻醉過深死亡被剔除，對照組1只、miRNA組2只因造模失敗被剔除，隨后在同一時間點通過隨機抽樣原則補齊動物并重新造模。

造模成功后，3組大鼠均出現嚴重的雙后肢癱瘓及尿潴留，進食及活動情況均較術前減少。隨實驗進展，3組大鼠活動及進食情況均逐漸好轉。細胞移植后3組大鼠BBB評分見表1。

表1 3組大鼠細胞移植后BBB評分比較(n=4)

F組間=28.717，F時間=54.586，F交互=24.865，P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

2.2 3組大鼠脊髓組織NF-200的表達 移植后第3天，3組均能觀察到少量NF-200表達，以損傷區(qū)周圍最多。隨實驗時間進展，3組NF-200陽性細胞均逐漸增多；4周時， miRNA組細胞出現形態(tài)學改變，且可見具有典型神經元形態(tài)的細胞。見圖1、表2。

2.3 3組大鼠脊髓組織GFAP的表達 移植后各時間點，3組均能觀察到GFAP表達，且隨時間變化其陽性表達面積呈持續(xù)性增高。見圖2、表3。

圖1 細胞移植4周后各組大鼠脊髓NF-200的表達(SABC，×400)

組別移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周對照組8.78±0.9112.52±0.8717.26±1.0921.08±1.9629.78±1.04BMSCs組9.78±1.0429.92±2.70*36.03±3.39*44.25±2.98*47.54±1.35*miRNA組9.57±0.8642.69±2.47*#49.22±1.08*#57.47±1.09*#66.00±1.97*#

F組間=1 064.605，F時間=749.806，F交互=66.560，P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

圖2 細胞移植4周后各組大鼠脊髓GFAP的表達(SABC，×400)

組別移植后第3天移植后1周移植后2周移植后4周移植后8周對照組2496.62±367.134107.93±351.945658.65±550.765818.14±325.795978.39±207.62BMSCs組2237.95±389.143515.56±542.14*4067.34±295.63*4027.93±112.77*3986.96±242.02*miRNA組2047.11±260.732306.41±426.87*#2985.25±274.80*#3145.20±171.90*#3015.83±367.66*#

F組間=187.241，F時間=82.313，F交互=9.994，P均<0.001；*：與對照組比較，P<0.05；#：與BMSCs組比較，P<0.05。

3 討論

脊髓損傷的治療主要圍繞兩個方面：神經細胞的再生和炎癥反應的抑制。干細胞移植技術是將具有向成體細胞分化潛能的干細胞(如神經干細胞、BMSCs等)移植到體內，以達到修復或替換受損細胞或組織的目的。BMSCs在特定的微環(huán)境下可分化為神經元樣細胞[9-11]。另外發(fā)現BMSCs不僅能為損傷神經的軸突再生提供基本骨架，而且其分泌的多種神經營養(yǎng)因子參與損傷神經的修復[12-14]。

miRNA作為一種廣泛存在的生物體調控物質，在細胞的增殖、分化和凋亡中起重要作用。Simmons等[15]發(fā)現miRNA let-7b以T淋巴細胞白血病同源蛋白和細胞周期蛋白D1為靶點促進BMSCs分化為神經元，通過激活Wnt信號來調控神經干細胞的自我修復和更新。NF是構成神經元胞體和神經軸突細胞骨架的主要成分，其在維持神經元的功能中起重要作用，且脊髓損傷后NF-200陽性神經元數量及胞體著色程度與后肢功能恢復密切相關[16]。GFAP是構成神經膠質細胞的骨架蛋白，脊髓損傷后期其合成和分泌均大量增加，GFAP的表達水平可以反映星形膠質細胞的功能狀態(tài)，其大量增生形成的膠質瘢痕可能阻礙神經軸突的生長，抑制損傷神經的修復[17-18]。

該研究中發(fā)現3組大鼠NF-200的表達均隨實驗的進展逐漸增加，且miRNA組在相同時間點均高于BMSCs組和對照組，而GFAP陽性表達面積降低。以上提示miRNA let-7b可能促進BMSCs向神經元分化，分化的神經元大量表達NF-200并減少膠質瘢痕形成，以促進神經恢復。

綜上所述，該研究結果表明，miRNA let-7b在BMSCs向神經元細胞的分化過程中起重要調控作用，并通過促進軸突再生抑制膠質瘢痕形成，為損傷神經的恢復提供有利的外環(huán)境。但該實驗是以動物模型為研究對象，其安全性仍需進一步研究。

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(2014-08-09 收稿 責任編輯姜春霞)

Effects of miRNA let-7b-modified bone mesenchymal stem cells transplantation on expressions of NF-200 and GFAP in rats with spinal cord injury

XUYusheng1),CUIHao1),ZHANGSong1),WANGPeisong1),ZHUHaiyang1),ZHONGBin1),MIAOJinhong2)

1)DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)Key-DisciplinesLaboratoryforClinicalMedicineofHenanProvince,Zhengzhou450052

miRNA let-7b;BMSC;spinal cord injury;cell transplantation;rat

Aim: To explore the effects of miRNA let-7b-modified BMSCs transplantation on the repair of nerve in rats with spinal cord injury.Methods: A total of 60 SD rats were randomly divided into 3 groups：control group,BMSCs group, and miRNA group, each group including 20 rats. At 1 week after the spinal cord injury model being established, the control group received physical saline, the BMSCs group was injected with BMSCs,and the miRNA group was treated with BMSCs transfected with miRNA let-7b. The neurological functions were evaluated using the BBB scale after operation.NF-200 and GFAP were detected.Results: After cell transplantation, the BBB scores were the lowest in control group and lower in BMSCs group(P<0.05). After implantation，NF-200-positive cells of miRNA group was much more than the other two groups, while the GFAP positive area was the lowest in miRNA group and lower in BMSCs group(P<0.05).Conclusion: miRNA let-7b may play an important role in the differentiation of BMSCs into neurons, and promote recovery of injured spinal cord through decreasing the formation of glial scar.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.024

R651.2