魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤細胞譜效關系*

張壯麗，趙 寧，趙志鴻，張小俊，王桂芳

1)河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

魚腥草揮發(fā)油抗淋巴瘤細胞譜效關系*

張壯麗1)△，趙 寧2)，趙志鴻1)，張小俊1)，王桂芳1)

1)河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室 鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院 鄭州 450001

△女，1978年1月生，博士，助理研究員，研究方向：中藥新藥，E-mail：zzl7814@163.com

魚腥草揮發(fā)油；GC-MS；譜效關系；淋巴瘤

目的：以魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜峰面積和其對Raji細胞的抑制率為基礎進行譜效關系分析，以確定魚腥草揮發(fā)油抗腫瘤的藥效成分組。方法：通過GC-MS技術獲取不同產地魚腥草揮發(fā)油的色譜圖，通過MTT實驗考察不同產地魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率，采用偏最小二乘回歸分析技術對色譜峰與抑制率的內在聯系進行譜效分析。結果：GC-MS特征譜中色譜峰6、14、15、22、25、26、27和細胞抑制率具有較強的正相關關系，其代表物質對抗腫瘤藥效貢獻較大，為抗腫瘤藥效成分組。結論：魚腥草揮發(fā)油的抗腫瘤作用是多種成分共同作用的結果。

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜全草，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效。魚腥草揮發(fā)油是該藥材的主要活性成分[1]，具有抗病毒、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗過敏、利尿、增強機體免疫功能、抗腫瘤等藥理作用[2-9]。目前魚腥草揮發(fā)油的質量鑒定主要以化學成分為指標，與藥效脫節(jié)。該實驗采用偏最小二乘回歸分析(PLS)對13個產地的魚腥草揮發(fā)油氣相色譜-質譜(GC-MS)特征譜與揮發(fā)油對Raji細胞抑制率的內在聯系進行譜效分析，建立特征峰面積對腫瘤細胞抑制率的回歸方程，以期找到魚腥草揮發(fā)油抗腫瘤的主要藥效成分。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥材 魚腥草樣品分別采收自四川、重慶和云南等主產地，其中四川、重慶地區(qū)7個產地：四川大邑縣出江鎮(zhèn)(編號1)，四川崇州三江鎮(zhèn)王橋村(編號2)，四川犍為縣(編號7)，四川雅安市(編號8)，重慶市(編號9)，四川巴中市平昌縣筆山鎮(zhèn)獅嶺村(編號10)，四川成都荷花池藥材市場(編號11)；云南省6個產地：云南西雙版納勐?？h南糯山(編號3)，云南保山市施甸縣舊城鄉(xiāng)(編號4)，云南保山市施甸縣仁和鄉(xiāng)(編號5)，云南保山市龍陵縣平達鄉(xiāng)(編號6)，云南玉溪市峨山縣小街鎮(zhèn)(編號12)，云南紅河州石屏縣異龍鎮(zhèn)(編號13)。

1.1.2 試劑和細胞株 正己烷(色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司)，無水硫酸鈉(分析純，天津市凱通化學試劑有限公司)，重蒸水、RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO(北京索萊寶生物醫(yī)藥科技有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，MTT(美國Sigma公司)。Raji細胞株(河南省醫(yī)藥科學研究院藥化室保存和自行傳代培養(yǎng))。

1.1.3 儀器 7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀、Hp-5 MS毛細管色譜柱(美國安捷倫公司)，電子天平、生物安全柜、臺式高速冷凍離心機(香港力康發(fā)展有限公司)，顯微鏡[舜宇光學科技(集團)有限公司]，超凈工作臺[凈化設備(蘇州)公司]，高壓滅菌鍋(日本Hirayama公司)，CO2培養(yǎng)箱[施都凱儀器設備(上海)有限公司]，氣浴恒溫振蕩器(江蘇金壇市中大儀器廠)，酶標儀(美國Bio-Rad公司)，96孔板、50 mL細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)。

1.2 魚腥草揮發(fā)油的制備 將干燥魚腥草藥材粉碎后，稱取100 g，裝入2 000 mL圓底燒瓶中，加蒸餾水，混勻并浸泡一定時間后提取揮發(fā)油[10]。收集所得淺黃色揮發(fā)油，精密稱量，計算揮發(fā)油提取率，封裝、凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 不同產地魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜的繪制

1.3.1 樣品溶液的配制 精密量取揮發(fā)油7.5 μL，加1.5 mL正己烷，并用無水硫酸鈉除水，5 000 r/min離心10 min，抽取上清液即得體積分數0.5%的樣品溶液。

MS條件：接口溫度280 ℃，電離方式為EI電離，電離能量70 eV，離子源溫度230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃，溶劑延遲3 min，掃描質量范圍:質荷比 20～500 amu。

1.4 魚腥草揮發(fā)油對腫瘤細胞的抑制實驗 將制備好的13個產地的魚腥草揮發(fā)油加DMSO溶解，分別配制成體積分數0.100 0%、0.020 0%、0.004 0%、0.001 3%的樣品溶液。取96孔板，設置給藥組和空白組，將Raji單細胞懸液接種于96孔板，103～104個/孔，給藥組分別加入不同劑量揮發(fā)油溶液，空白組加等體積的空白培養(yǎng)液，加樣后總液量為100 μL/孔。將加完樣的96孔板置培養(yǎng)箱中于37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養(yǎng)72 h。然后每孔加5 g/L的MTT 20 μL，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出后離心，小心棄去上清液，每孔加150 μL DMSO并將培養(yǎng)板置于微孔板振蕩器上振蕩10 min，使結晶物充分溶解。用酶標儀在570 nm波長處測量各孔吸光度(A) 值，并計算細胞抑制率：抑制率=(1-給藥孔A值/空白孔A值)×100%。實驗重復3次。

1.5 PLS法分析譜效關系 以體積分數0.001 3%揮發(fā)油對腫瘤細胞的抑制率為因變量(Y)，以29個考察峰峰面積為自變量(X)，進行譜效關系分析。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 出峰情況考察 結果見圖1。所有成分均能在1 h內出峰，且基本達到基線分離。

圖1 魚腥草揮發(fā)油GC-MS記錄圖

2.1.2 穩(wěn)定性考察 相對保留時間比值(RRT)和峰面積比值(RPA)的RSD值分別小于0.02%和2.57%，表明樣品溶液在24 h內性質穩(wěn)定。

2.1.3 精密度考察 RRT和RPA的RSD值分別小于0.10%和2.61%，表明儀器的精密度良好。

2.1.4 重復性考察 RRT和RPA的RSD值分別小于0.12%和2.63%，表明該方法的重復性較好。

2.2 譜圖分析 13個產地魚腥草揮發(fā)油的GC-MS色譜圖見圖2。特征峰鑒定結果見表1，經譜庫檢索并參考文獻[11]，推測25號峰簇可能為表中所列幾個化合物的組合。

2.3 魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率 結果見表2。由表2可知，魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞具有很好的抑制效果，揮發(fā)油劑量為體積分數0.001 3%時多數產地的魚腥草揮發(fā)油仍能達到50%左右的抑制率。

2.4 PLS法分析譜效關系 結果顯示回歸方程為：Y=1.003×10-13-0.261X1-0.281X2-0.018X3-0.165X4-0.226X5+0.192X6-0.201X7-0.030X8-0.273X9+0.036X10-0.114X11+0.058X12-0.063X13+0.099X14+0.201X15+0.025X16-0.142X17-0.040X18+0.039X19-0.065X20-0.076X21+0.281X22-0.353X23-0.037X24+0.393X25+0.137X26+0.101X27-0.160X28-0.076X29。可見，29個自變量的回歸系數有正、有負。其中X6、X14、X15、X22、X25、X26、X27和細胞抑制率具有較強的正相關關系，特征峰成分鑒定為對傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯。

圖2 13個產地魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征譜

峰號t(保留)/min化合物峰號t(保留)/min化合物14.853α-蒎烯1613.034α-萜品醇25.274莰烯1713.584正癸醛35.971β-水芹烯1814.493正壬醇46.083β-蒎烯1915.522芳樟醇56.460β-月桂烯2016.265環(huán)辛烷67.541對傘花烴2116.833左旋乙酸冰片酯77.674D-檸檬烯2217.241甲基正壬酮88.648γ-萜品烯2318.002α-環(huán)香葉醇醋酸酯99.609萜品油烯2418.596癸酸甲酯1010.013紫蘇烯2520.851～21.582十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯1110.130壬醛2621.9422-十二烷酮1212.135L-龍腦2723.003石竹烯1312.328正壬醇2827.8502-十三烷酮1412.544(-)-4-萜品醇2933.105氧化石竹烯1512.8282,4,6-三甲基苯甲醇

表2 魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞的抑制率(n=3) %

3 討論

分析方法和數據處理技術是譜效關系研究的關鍵[12]。該實驗樣本數為13(產地)，遠少于自變量數(特征峰)，且中藥特征譜在建立譜效關系模型時色譜峰之間可能存在多重共線性，不適用普通多元線性回歸分析。PLS對于處理這類樣本量小、自變量多且變量間存在多重相關性問題的數據樣本具有獨特優(yōu)勢，并可同時實現回歸建模、數據結構簡化以及2組變量間的相關分析，在最終模型中將包含原有的所有自變量，從而最大限度地利用數據信息[13]。

該實驗采用PLS方法對13個產地的魚腥草揮發(fā)油GC-MS特征峰峰面積與魚腥草揮發(fā)油對Raji細胞抑制率之間進行譜效關系分析。結果表明，特征峰6、14、15、22、25、26、27和細胞抑制率具有較強的正相關關系。由此可得出結論：魚腥草揮發(fā)油的抗淋巴瘤藥效物質組包括對傘花烴、(-)-4-萜品醇、2,4,6-三甲基苯甲醇、甲基正壬酮、十一醇、正癸酸、乙酸香葉酯、2-十二烷酮和石竹烯，其對Raji細胞的抑制作用應為這些物質協同作用的結果。

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(2014-09-09 收稿 責任編輯姜春霞)

Spectrum-effect relationship of GC-MS spectrum of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb with antilymphoma effect

ZHANGZhuangli1)，ZHAONing2)，ZHAOZhihong1)，ZHANGXiaojun1)，WANGGuifang1)

1)MedicalChemistrySection,HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

volatile oil from Houttuynia cordata Thunb; GC-MS; spectrum-effect relationship; lymphoma

Aim: To study the spectrum-effect relationship on the basis of GC-MS chromatogram and data of the inhibition rate on Raji cells, in order to definite the anti-tumor active ingredient of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb. Methods: The inherent connections were studied between GC-MS chromatogram and inhibition rate with partial least squares regression analysis. Results: There were 7 peaks such asX6,X14,X15,X22,X25,X26,X27 of the GC-MS chromatogram played the most important role in the anti-tumor effect, with high positive relationship, and were determined as effective compounds. Conclusion: The anti-tumor effect of volatile oil from Houttuynia cordata Thunb is the result of combined effect of several components.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.018

*河南省省屬科研單位社會公益項目預研專項 2013,2014；河南省重點科技攻關計劃項目 142102310433

R285.5