丙泊酚對(duì)HepG2肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力的影響*

高 巍，宋平義，景桂霞#，張曉琪，南克俊，沙保勇

1)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院麻醉科 西安 710061 2)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 西安 710061 3)西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 西安 710021

丙泊酚對(duì)HepG2肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力的影響*

高 巍1)，宋平義1)，景桂霞1)#，張曉琪1)，南克俊2)，沙保勇3)#

1)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院麻醉科 西安 710061 2)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 西安 710061 3)西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 西安 710021

#通信作者：沙保勇，男，1982年3月生，博士，講師，研究方向：中樞神經(jīng)功能損傷與重建，E-mail:shabaoyong@gmail.com；景桂霞，女，1958年9月生，教授，研究方向：麻醉藥物對(duì)腫瘤的影響，E-mail：jgx666@126.com

丙泊酚；肝母細(xì)胞瘤；MMP-2；MMP-9;TIMP-1；侵襲

目的：探討丙泊酚對(duì)HepG2肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力的影響及相關(guān)機(jī)制。方法：用不同質(zhì)量濃度(0、3、6、9和12 mg/L)丙泊酚培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h后，通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測侵襲率；培養(yǎng)24、48和72 h后用MTT法檢測細(xì)胞活性；培養(yǎng)48 h后采用RT-PCR和Western blot法檢測細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA及MMP-2、MMP-9和TIMP-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：隨丙泊酚質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞的侵襲能力逐漸降低(F=4 883.900，P<0.001)，細(xì)胞活性逐漸降低(F=38.334，P<0.001)，MMP-2及MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)亦逐漸降低(P<0.05)，而TIMP-1蛋白的表達(dá)逐漸升高(F=44.918，P<0.001)。結(jié)論：丙泊酚能降低HepG2細(xì)胞的侵襲能力及細(xì)胞活性，其機(jī)制與抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)及促進(jìn)TIMP-1蛋白的表達(dá)有關(guān)。

丙泊酚(propofol)是烷基酚類短效靜脈麻醉藥。除麻醉作用外，丙泊酚還可影響腫瘤的生物學(xué)行為，但對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞有不同的作用效果[1-3]。丙泊酚可通過調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流重組肌動(dòng)蛋白，增強(qiáng)乳癌細(xì)胞的遷移能力[4]。作為γ-氨基丁酸A(GABAA)受體的激動(dòng)劑，丙泊酚可通過激活GABAA受體，減少基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的生成及降低其活性，從而抑制大腸癌細(xì)胞的侵襲[5]。將骨肉瘤細(xì)胞移植到大鼠背部皮下后， 40 mg/(kg·d)的丙泊酚腹腔持續(xù)泵注能降低肺轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的數(shù)量，但無法抑制其生長[1]。通過激活核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)上調(diào)血紅素氧合酶-1的表達(dá)，丙泊酚可促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移,并抑制其凋亡[6]。

肝母細(xì)胞瘤為兒童肝臟高發(fā)病率腫瘤，肝母細(xì)胞瘤手術(shù)過程及術(shù)后鎮(zhèn)靜均會(huì)大量用到丙泊酚，但有關(guān)丙泊酚對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲能力的影響及機(jī)制的研究較少。因此，作者對(duì)丙泊酚處理后肝母細(xì)胞瘤HepG2細(xì)胞侵襲能力進(jìn)行了觀察，并對(duì)其MMP-2、MMP-9及TIMP-1的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，以期為肝母細(xì)胞瘤手術(shù)中丙泊酚的使用及術(shù)后鎮(zhèn)靜藥物的選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源 HepG2細(xì)胞由西安交通大學(xué)腫瘤內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供，于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、終濃度為100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃和體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)好的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液購自Gibco公司，胎牛血清購自Hyclone公司，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自Thermo公司，MMP-2、MMP-9及TIMP-1抗體購自Cell Signaling Technology公司，竟安丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液購自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，脂肪乳購自華瑞制藥有限公司。如非特殊說明，其他試劑耗材均購自Sigma公司。

1.4 細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)好的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為5×104mL-1)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、3、6、9及12 mg/L的丙泊酚或脂肪乳，培養(yǎng)24、48和72 h。完成孵育后，取出96孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液并用PBS清洗，加入含MTT(終質(zhì)量濃度為5 g/L)的DMEM培養(yǎng)液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加100 μL二甲基亞砜，搖床振蕩溶解結(jié)晶物。以630 nm 處吸光度(A)為參照，用酶聯(lián)免疫檢測儀(Multiskan Go)測量570 nm 處的A，計(jì)算細(xì)胞活性。細(xì)胞活性=[(實(shí)驗(yàn)組A(570 nm)-實(shí)驗(yàn)組A(630 nm)]/[(正常對(duì)照組A(570 nm)-正常對(duì)照組A(630 nm)]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)4個(gè)復(fù)孔。

1.5 HepG2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9和TIMP-1 mRNA和蛋白的檢測 將培養(yǎng)好的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后加入6孔板中(細(xì)胞密度為5×105mL-1)，待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、3、6、9及12 mg/L的丙泊酚或脂肪乳培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，分別進(jìn)行HepG2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 mRNA(RT-PCR法)和MMP-2、MMP-9 及TIMP-1蛋白(Western Blot法)的測定。

1.5.1 RT-PCR 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR。MMP-2引物上游:5’-TCCCCTTCTTGTTCAATGG-3’，下游：5’-GGAAGCG GAATGGAAACTT-3’。MMP-9引物上游：5’-CGAT GACGAGTTGTGGTCC-3’，下游：5’-GTACTGCAC CAGGGCAAGC-3’。于無菌無酶PCR管中配制50 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為94 ℃60 s，60 ℃50 s，72 ℃90 s，40次循環(huán)后，72 ℃延伸10 min；4 ℃保存以備20 g/L瓊脂糖凝膠電泳。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)2個(gè)復(fù)孔。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。不同質(zhì)量濃度丙泊酚或脂肪乳處理后HepG2細(xì)胞侵襲率，MMP-2、MMP-9和TIMP-1表達(dá)的比較采用單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)，細(xì)胞活性的比較采用5×3析因設(shè)計(jì)的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲率的影響 見圖1和表1?？梢钥闯?，HepG2細(xì)胞的侵襲率隨丙泊酚質(zhì)量濃度的增加而降低。

圖1 丙泊酚(A)及脂肪乳(B)處理后的HepG2細(xì)胞(Transwell，×400)

表1 丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲率的影響 %

丙泊酚組各濃度間兩兩比較，P均<0.05。

2.2 丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞細(xì)胞活性的影響 0、3、6、9和12 mg/L的脂肪乳作用24～72 h后，HepG2細(xì)胞活性無明顯變化(表2)。0、3、6、9和12 mg/L的丙泊酚作用24～72 h后，隨著丙泊酚質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞活性降低并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性(表3)。

表2 脂肪乳對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響(n=12) %

F時(shí)間=0.394,P=0.687；F濃度=3.266,P=0.072；F交互=0.187,P=0.991。

表3 丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響(n=12) %

F時(shí)間=12.090,P=0.004；F濃度=38.334,P<0.001；F交互=14.078,P<0.001。

2.3 丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞中相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的影響 丙泊酚及脂肪乳處理48 h后，HepG2細(xì)胞中MMP-2及MMP-9 mRNA的表達(dá)情況見圖2?？梢钥闯觯S丙泊酚質(zhì)量濃度的增加，MMP-2及MMP-9 mRNA條帶逐漸變淺，提示HepG2細(xì)胞中兩者表達(dá)逐漸減弱。MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白的表達(dá)情況見圖3、表4和表5?？梢?，隨丙泊酚質(zhì)量濃度的增加，HepG2細(xì)胞中MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)逐漸下降，TIMP-1蛋白表達(dá)逐步升高。

圖2 丙泊酚(上)及脂肪乳(下)對(duì)MMP-2和MMP-9 mRNA表達(dá)的影響

1～5：分別為0、3、6、9和12 mg/L丙泊酚或脂肪乳作用48 h后MMP-2 mRNA的表達(dá)；6～10：分別為0、3、6、9和12 mg/L丙泊酚或脂肪乳作用48 h后MMP-9 mRNA的表達(dá)；M:Marker。

圖3 丙泊酚及脂肪乳對(duì)MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

A:丙泊酚；B：脂肪乳；C：內(nèi)參；1～5：分別為0、3、6、9和12 mg/L。

表4 脂肪乳對(duì)MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

表5 丙泊酚對(duì)MMP-2、MMP-9及TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

*:與0 mg/L相比。

3 討論

肝母細(xì)胞瘤發(fā)病隱匿，惡性程度高，發(fā)展迅速，可通過血液和淋巴途徑轉(zhuǎn)移到肺、腹腔、腦等部位，僅1/3的肝母細(xì)胞瘤患者術(shù)后可存活5 a，患者多因癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而死亡[7]。目前，手術(shù)治療已成為國內(nèi)外治療肝母細(xì)胞瘤的首選方法，無論是手術(shù)過程中還是術(shù)后鎮(zhèn)靜，都會(huì)大量用到丙泊酚。因此，丙泊酚對(duì)肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響也逐漸受到人們的關(guān)注[8]。

該研究采用不同質(zhì)量濃度的丙泊酚和脂肪乳處理HepG2細(xì)胞，觀察細(xì)胞侵襲能力的變化。臨床上使用的丙泊酚一般為白色、均勻、乳狀的注射液，含有助于丙泊酚溶解的大豆油和脂肪乳。在該研究中使用的丙泊酚實(shí)際為丙泊酚中/長鏈脂肪乳注射液。為明確丙泊酚這種物質(zhì)對(duì)腫瘤細(xì)胞行為的影響，該研究中所有實(shí)驗(yàn)均以脂肪乳作為對(duì)照。臨床手術(shù)時(shí)，丙泊酚的血漿濃度范圍為3～8 mg/L[9]。考慮到90%的丙泊酚通過肝臟代謝，丙泊酚有在肝臟中富集的可能性[10]，故該研究選用3、6、9和12 mg/L的丙泊酚處理HepG2細(xì)胞，探究其對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響及潛在機(jī)制，更切合臨床實(shí)際。

侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的標(biāo)志特征之一。腫瘤細(xì)胞需要克服細(xì)胞外基質(zhì)和多種細(xì)胞因子構(gòu)成的物理化學(xué)屏障后，才能侵入到周圍組織，進(jìn)而侵入循環(huán)系統(tǒng)[11]。因此，基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的降解成為腫瘤細(xì)胞能否侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的酶主要是MMPs，尤其是MMP-2和MMP-9[11]。該研究中，經(jīng)丙泊酚處理后的HepG2細(xì)胞侵襲能力降低，細(xì)胞活性降低并呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，TIMP-1表達(dá)升高，MMP-2及MMP-9的表達(dá)下降，這與丙泊酚抑制SMMC-7721侵襲的結(jié)果[12]相似。MMP-2在腫瘤發(fā)生的早期能改變組織原有的特異結(jié)構(gòu)，為腫瘤細(xì)胞提供合適的生長微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[13]。MMP-2還能誘導(dǎo)細(xì)胞表面黏附分子水解脫落，激活更多細(xì)胞因子，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的代謝及凋亡[14-15]。MMP-9與Ⅳ型膠原有高度親和力，能發(fā)揮基底膜降解酶的作用，在腫瘤侵襲中作用極其重要[16]。而且，MMP-9能誘導(dǎo)蛋白聚糖β亞基和連接蛋白-1的裂解，增強(qiáng)腫瘤的原位分離和侵襲[17]。作為MMPs抑制劑的TIMP-1，其在侵襲能力強(qiáng)的腫瘤中低表達(dá)，在侵襲能力弱的腫瘤中高表達(dá)[18]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，作者認(rèn)為丙泊酚可能通過上調(diào)TIMP-1的表達(dá)，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)，降低HepG2細(xì)胞的侵襲能力。

總之，該研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲能力有抑制作用，這為將丙泊酚用于腫瘤侵襲抑制提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但要真正實(shí)現(xiàn)丙泊酚在緩解腫瘤患者痛苦的同時(shí)發(fā)揮抑癌的雙重作用，還需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，并需考慮諸多臨床實(shí)際問題。

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(2014-09-15 收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effects of propofol on the invasion ability of hepatoblastoma HepG2 cells

GAOWei1),SONGPingyi1),JINGGuixia1),ZHANGXiaoqi1),NANKejun2),SHABaoyong3)

1)DepartmentofAnesthesiology,theFirstAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061 2)DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061 3)InstituteofBasicMedicalSciences,Xi′anMedicalUniversity,Xi′an710021

propofol;hepatoblastoma;MMP-2;MMP-9;TIMP-1;invasion

Aim: To investigate the effects and related mechanism of propofol on the invasion ability of HepG2 cells. Methods: Different concentrations(0,3,6,9 and 12 mg/L) of propofol were used to treat HepG2 cells. The invasion ability was detected by Transwell after 24 h treatment; cell viability of HepG2 cells was studied through MTT assay after 24,48,and 72 h treatment. The expressions of MMP-2，MMP-9 and TIMP-1 were measured through RT-PCR and Western blot after 48 h treatment. Results: The invasion ability and cell viability of HepG2 cells, the mRNA and protein expressions of MMP-2 and MMP-9, were significantly decreased with the increase of propofol concentration(P<0.05). The protein expression of TIMP-1 was significantly increased with the increase of propofol concentration(F=44.918，P<0.001). Conclusion: Propofol could reduce the invasive activity and cell viability of HepG2 cells through the inhibition of MMP-2 and MMP-9, and overexpression of TIMP-1.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.003

*國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目 81301308，81301040；陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目 2014JQ4158；陜西省青年科技新星項(xiàng)目 2014KJXX-76

R735.7