BMP4、VEGF、sFlt1多基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染肌源性細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)成骨過(guò)程的影響*

李 毅，劉冠磊，唐豪杰，張 寶，袁洪濤，許建中，李廣恒

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

BMP4、VEGF、sFlt1多基因逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染肌源性細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)成骨過(guò)程的影響*

李 毅，劉冠磊，唐豪杰，張 寶，袁洪濤，許建中#，李廣恒#

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通信作者:李廣恒，男，1973年6月生，博士，教授，研究方向：骨與軟骨再生，E-mail：liguangheng@hotmail.com；許建中，男，1964年9月生，博士，教授，研究方向：關(guān)節(jié)與運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)，E-mail:13937133786@163.com

肌源性細(xì)胞；基因治療；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；小鼠

目的：研究以肌源性細(xì)胞為基礎(chǔ)的BMP4、VEGF、sFlt1多基因治療在小鼠體內(nèi)對(duì)成骨過(guò)程的影響。方法：分別以2種肌源性細(xì)胞C2C12 和PM為細(xì)胞載體，用BMP4、VEGF、sFlt1逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行重復(fù)轉(zhuǎn)染。2種肌源性細(xì)胞分別重復(fù)轉(zhuǎn)染后，產(chǎn)生6組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，分別是C2C12-B-sFlt1、C2C12-B、C2C12-B-VEGF、PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF。6組細(xì)胞在體外復(fù)合明膠海綿后分別植入小鼠的股肌袋內(nèi)。術(shù)后不同時(shí)間應(yīng)用組織學(xué)、X線檢查觀察各組的成骨量以及軟骨化骨的組織學(xué)演變過(guò)程。結(jié)果：C2C12-B-sFlt1和C2C12-B 2組細(xì)胞在體內(nèi)可引發(fā)軟骨化骨過(guò)程，2組的成骨量在特定的時(shí)間段內(nèi)無(wú)明顯區(qū)別，但X線檢查顯示2組的成骨空間方向不盡相同。C2C12-B-VEGF在體內(nèi)沒(méi)有誘發(fā)軟骨化骨的過(guò)程，其所誘發(fā)的組織學(xué)過(guò)程類似血管瘤。PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF 3組細(xì)胞在體內(nèi)誘發(fā)軟骨化骨的過(guò)程較為類似，3組的成骨量在35 d的觀察期內(nèi)無(wú)明顯區(qū)別。結(jié)論：骨骼肌源性細(xì)胞可作為BMP4基因治療的基礎(chǔ)細(xì)胞，而在增加了VEGF 和sFlt1基因的復(fù)合基因轉(zhuǎn)染后，其軟骨化骨的表現(xiàn)具有細(xì)胞種群的特異性。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)植入骨骼肌后可誘導(dǎo)產(chǎn)生異位軟骨化骨，該過(guò)程的細(xì)胞分化機(jī)制為BMP誘導(dǎo)骨骼肌內(nèi)的肌源性細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，隨后血管內(nèi)皮細(xì)胞趨化、積聚導(dǎo)致新生血管形成，從而在特定的時(shí)間內(nèi)形成異位骨化[1-2]?；谠摶A(chǔ)研究而發(fā)展起來(lái)的以骨骼肌源性細(xì)胞為基礎(chǔ)的成骨基因治療也逐漸成為骨組織工程領(lǐng)域的研究重點(diǎn)[3]。該研究中采用多基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察肌源性細(xì)胞在促進(jìn)骨形成基因BMP4和血管形成基因血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)以及VEGF受體拮抗劑soluble fms-like tyrosine kinase-1(sFlt-1)的共同作用下其成骨過(guò)程的變化。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 C2C12 細(xì)胞購(gòu)買于美國(guó)ATCC公司。PM細(xì)胞為應(yīng)用多酶解技術(shù)從C57BL6J小鼠的股四頭肌內(nèi)分離出來(lái)的肌源性細(xì)胞[4]。2種細(xì)胞都在含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)10%馬血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的條件是體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃。細(xì)胞培養(yǎng)液2～3 d更換1次。細(xì)胞在約50%融合時(shí)開始傳代。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL6J小鼠作為分離出原代肌源性細(xì)胞的宿主。SCID 小鼠作為各組細(xì)胞植入股肌袋內(nèi)完成體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的小鼠。所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都經(jīng)鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 裝載BMP4、VEGF、sFlt1逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建 裝載人BMP4基因質(zhì)粒(pCLBMP4)、VEGF165 cDNA(pCLVEGF)、sFlt1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的制備是應(yīng)用經(jīng)典三質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，收集得到純化的上清液[5]。根據(jù)上述方法得到的3種病毒分別表示為裝載人BMP4基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retro-BMP4)、裝載人VEGF165基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retro-VEGF)、裝載sFlt-1基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Retro-sFlt1)。

1.4 病毒細(xì)胞轉(zhuǎn)染 分別在體外培養(yǎng)細(xì)胞至50%融合時(shí)，從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中吸出培養(yǎng)液，PBS清洗之后加入10 mL Retro-BMP4的病毒懸液(1×109～5×109cfu/L)和10 mL的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM以及溴化己二甲銨(8 mg/L)，每隔16 h更換1次病毒懸液，3次共48 h完成病毒轉(zhuǎn)染。C2C12-BMP4(轉(zhuǎn)染過(guò)Retro-BMP4的C2C12細(xì)胞，C2C12-B)作為C2C12細(xì)胞組中的一個(gè)亞組。在C2C12-BMP4細(xì)胞的基礎(chǔ)上再次分別應(yīng)用Retro-VEGF和Retro-sFlt1進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。按上述辦法轉(zhuǎn)染小鼠原代分離培養(yǎng)的肌源性細(xì)胞。經(jīng)過(guò)這樣的病毒轉(zhuǎn)染共產(chǎn)生6組細(xì)胞，分別為C2C12-B-sFlt1、C2C12-B、C2C12-B-VEGF、PM-B-sFlt1、PM-B、PM-B-VEGF細(xì)胞組。這6組細(xì)胞產(chǎn)生后，分別應(yīng)用相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)，并應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒進(jìn)行分泌蛋白檢測(cè)，以確定細(xì)胞轉(zhuǎn)染的有效性。

1.5 細(xì)胞植入小鼠體內(nèi) 6組細(xì)胞在體外培養(yǎng)達(dá)到一定數(shù)目的時(shí)候，分別經(jīng)胰蛋白酶消化，取100 μL含2×105個(gè)細(xì)胞的懸液滴入預(yù)先制備的6 mm×6 mm大小的無(wú)菌明膠海綿塊上，然后將吸附有病毒的明膠海綿通過(guò)切開植入的方法植入SCID 小鼠的股肌袋內(nèi)，并在術(shù)后的第7、10、14、20、27、35天對(duì)植入物進(jìn)行各項(xiàng)檢查。

1.6 X線放射學(xué)和新形成軟骨、骨的組織學(xué)檢查及鏡下定量分析 所有經(jīng)細(xì)胞植入的小鼠在術(shù)后第28天于麻醉下進(jìn)行X線檢查。部分PM細(xì)胞組的植入小鼠在術(shù)后6個(gè)月時(shí)也進(jìn)行X線檢查。分別在術(shù)后第7、10、14、20、27、35天處死小鼠，采集標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)檢查，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組小鼠采集3個(gè)標(biāo)本。采集后的標(biāo)本經(jīng)快速冰凍切片，然后行Alcian藍(lán)/伊紅染色和Von Kossa/伊紅染色并進(jìn)行觀察。Alcian藍(lán)/伊紅染色用于軟骨組織的染色，正常的軟骨組織在該染色的作用下為藍(lán)色。Von Kossa/伊紅用于骨組織的染色，正常的骨組織在該染色的作用下為黑色。應(yīng)用Northern Eclipse成像系統(tǒng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行拍照，每個(gè)標(biāo)本選擇5張全景的組織學(xué)染色的片子(放大10倍)進(jìn)行骨和軟骨組織的定量分析。

2 結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染2種細(xì)胞的有效性 6組轉(zhuǎn)染過(guò)的細(xì)胞上清液中都檢測(cè)出了對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的存在，而未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清液中未檢測(cè)到對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)。

2.2 植入體內(nèi)的3組C2C12細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn) 3組C2C12細(xì)胞(C2C12-B、C2C12-B-VEGF、C2C12-B-sFlt1)表現(xiàn)出不太相同的成骨特點(diǎn)。C2C12-B-VEGF細(xì)胞組的表現(xiàn)較為特殊，該組在植入術(shù)后的任何觀察時(shí)間段均未見(jiàn)骨組織的形成；在觀察的后期，即術(shù)后第27和35天可見(jiàn)該組在體內(nèi)形成的組織具有多個(gè)管腔，管腔內(nèi)有大量的紅細(xì)胞，形成的整個(gè)組織具有類似血管瘤的組織學(xué)特點(diǎn)(圖1)。經(jīng)Alcian藍(lán)/伊紅染色后，C2C12-B組呈現(xiàn)出較為正常的軟骨化骨過(guò)程，軟骨組織在植入術(shù)后的第7～10天出現(xiàn)，第14天消失。C2C12-B-sFlt1組則表現(xiàn)出軟骨化骨過(guò)程的異常，該組軟骨組織在植入術(shù)后的第7～10天出現(xiàn)，14 d后消失，但術(shù)后第27天再次出現(xiàn)，并在第35天也可見(jiàn)到軟骨組織。C2C12-B-VEGF組則未表現(xiàn)出軟骨化骨的過(guò)程(圖2)。

2.3 植入體內(nèi)的3組PM細(xì)胞的組織學(xué)特點(diǎn) 3組PM細(xì)胞(PM-B、PM-B-VEGF、PM-B-sFlt1)表現(xiàn)出類似的成骨特點(diǎn)。骨組織在第10天左右出現(xiàn)，隨著時(shí)間的推移逐漸增多(圖3)。Alcian藍(lán)/伊紅染色后，3組細(xì)胞呈現(xiàn)出較為類似的軟骨化骨的過(guò)程，軟骨組織在植入術(shù)后的第7～10天出現(xiàn)，第14天消失(圖4)。

2.4 不同細(xì)胞組植入股肌袋內(nèi)術(shù)后的X線檢查 術(shù)后第28天X線檢查顯示，C2C12-B-sFlt1和C2C12-B植入的小鼠股肌袋中均可見(jiàn)新生骨的形成，而C2C12-B-VEGF組未見(jiàn)任何新生骨組織(圖5a)。3組PM細(xì)胞術(shù)后第28天的X線檢查表現(xiàn)類似，在小鼠的股肌袋內(nèi)均可見(jiàn)新生的骨組織形成(圖5b)。然而術(shù)后6個(gè)月的X線檢查顯示PM-B-sFlt1組的成骨量明顯多于PM-B和PM-B-VEGF組(圖5b)。

2.5 6組細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)形成的新生骨與軟骨組織的定量分析 C2C12-B-sFlt1和C2C12-B組的成骨和軟骨量類似，而C2C12-B-VEGF組無(wú)骨組織形成;3組PM細(xì)胞在35 d的觀察期內(nèi)成骨和成軟骨量類似(圖6)。

圖1 3組C2C12細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的成骨組織學(xué)觀察結(jié)果(Von Kossa/伊紅染色，×400)

A組：C2C12-B-sFlt1細(xì)胞組； B組：C2C12-B細(xì)胞組；C組：C2C12-B-VEGF細(xì)胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中黑色為陽(yáng)性骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖2 3組C2C12細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的成軟骨組織學(xué)觀察結(jié)果(Alcian藍(lán)/伊紅染色，×400)

A組：C2C12-B-sFlt1細(xì)胞組；B組：C2C12-B細(xì)胞組；C組：C2C12-B-VEGF 細(xì)胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中藍(lán)色為陽(yáng)性軟骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖3 3組PM細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的成骨組織學(xué)觀察結(jié)果(Von Kossa/伊紅染色，×400)

A組：PM-B-sFlt1細(xì)胞組；B組：PM-B細(xì)胞組；C組：PM-B-VEGF 細(xì)胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中黑色為陽(yáng)性骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、血管等。

圖4 3組PM細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的成軟骨組織學(xué)觀察結(jié)果(Alcian藍(lán)/伊紅染色，×400)

A組：PM-B-sFlt1細(xì)胞組；B組：PM-B細(xì)胞組；C組：PM-B-VEGF細(xì)胞組；從上至下分別為第7、10、14、20、27、35天。組織染色中藍(lán)色為陽(yáng)性軟骨組織，紅色為周圍軟組織，包括膠原、肌纖維和血管等。

圖5 6組細(xì)胞植入股肌袋內(nèi)術(shù)后的X線檢查結(jié)果

a：3組C2C12細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)第28天的X線檢查結(jié)果。A組：C2C12-B-sFlt1細(xì)胞組；B組：C2C12-B細(xì)胞組；C組：C2C12-B-VEGF 細(xì)胞組。b：3組PM細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)第28天(上排)和6個(gè)月(下排)的X線檢查結(jié)果。D組：PM-B-sFlt1細(xì)胞組；E組：PM-B細(xì)胞組；F組：PM-B-VEGF 細(xì)胞組。

圖6 6組細(xì)胞植入體內(nèi)后不同時(shí)間點(diǎn)的成骨、成軟骨定量變化圖

a、b：分別為C2C12-B-sFlt1(—◆—)、C2C12-B(—■—)、C2C12-B-VEGF(—▲—)組細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)后骨和軟骨組織的定量變化圖；c、d：分別為PM-B-sFlt1(—◆—)、PM-B(—■—)、PM-B-VEGF(—▲—)組細(xì)胞植入小鼠股肌袋內(nèi)后骨和軟骨組織的定量變化圖。

3 討論

關(guān)于肌源性細(xì)胞為基礎(chǔ)的BMP4基因治療可誘導(dǎo)新骨形成已經(jīng)有很多報(bào)道，但在此基礎(chǔ)上增加額外基因治療對(duì)其成骨過(guò)程的影響還不十分清楚[6-8]。VEGF 作為軟骨化骨過(guò)程中的一個(gè)重要生長(zhǎng)因子，在軟骨組織轉(zhuǎn)變成骨組織的階段起到了非常重要的作用[9-10]。在這個(gè)階段，軟骨組織中的軟骨細(xì)胞隨著時(shí)間的推移開始變得肥大。肥大的軟骨細(xì)胞高度表達(dá)VEGF, 從而誘導(dǎo)新生血管的形成。而新生血管的形成又促進(jìn)了新骨組織的形成和改建。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性、合理性，該研究同時(shí)采用了2種肌源性的細(xì)胞群。這樣設(shè)計(jì)的目的是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的代表性和實(shí)用性。

C2C12 肌源性細(xì)胞群與PM肌源性細(xì)胞群雖然都具有體外分化成肌母細(xì)胞的能力，但兩者的區(qū)別也是非常明顯的。C2C12細(xì)胞是從骨骼肌損傷修復(fù)的小鼠模型中分離出，在體外經(jīng)過(guò)多代的培養(yǎng)，最后形成的一組相對(duì)比較純的肌細(xì)胞群[11]。而PM細(xì)胞則是從小鼠骨骼肌內(nèi)分離出的原代細(xì)胞群，其中主要包含成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞兩大細(xì)胞群[12]。這些區(qū)別可能是造成2組細(xì)胞經(jīng)多基因轉(zhuǎn)染而表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為的原因。

C2C12細(xì)胞經(jīng)VEGF和BMP4的雙重轉(zhuǎn)染后喪失了體內(nèi)成骨作用，而抑制VEGF作用的C2C12-B-sFlt1細(xì)胞在新骨形成的量上和C2C12-B組并沒(méi)有很大區(qū)別。說(shuō)明在成骨過(guò)程中對(duì)VEGF的需要量是非常小的，而且對(duì)其抑制后的成骨量也沒(méi)有明顯的減少。PM細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果則和C2C12細(xì)胞略有不同，3組PM細(xì)胞的成骨過(guò)程在組織學(xué)、影像學(xué)和軟骨、骨組織的定量方面未見(jiàn)明顯的差異。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說(shuō)明，C2C12和PM雖然都是小鼠的肌源性細(xì)胞群，但經(jīng)多基因轉(zhuǎn)染后在體內(nèi)表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性。所以，該結(jié)果也提示應(yīng)用原代骨骼肌源性細(xì)胞作為BMP4基因治療的細(xì)胞載體是可行的。

在該研究中也發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)非常有趣的現(xiàn)象。首先，如果仔細(xì)觀察第28天的C2C12-B-sFlt1、PM-B-sFlt1組以及與之相對(duì)應(yīng)的C2C12-B和PM-B組，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染sFlt1組的細(xì)胞在成骨的三維空間結(jié)構(gòu)上與未轉(zhuǎn)染sFlt1組的細(xì)胞明顯不同。同樣的發(fā)現(xiàn)也出現(xiàn)在組織學(xué)檢查上。C2C12-B-sFlt1組在術(shù)后第28天仍可見(jiàn)軟骨組織形成和新骨的改建，而C2C12-B組在術(shù)后第14天時(shí)軟骨組織已經(jīng)全部吸收了。所以，轉(zhuǎn)染sFlt1組的細(xì)胞所引發(fā)的持續(xù)骨形成和改建過(guò)程很可能導(dǎo)致了新骨形成的空間排布不同。對(duì)這一點(diǎn)的進(jìn)一步理解可能為將來(lái)控制干細(xì)胞基因治療在體內(nèi)成骨的形狀提供線索。其次，C2C12-B-VEGF 組在植入小鼠的股肌袋內(nèi)非但沒(méi)有誘發(fā)成骨反應(yīng)，反而是術(shù)后早期局部出現(xiàn)軟組織腫塊，后期該腫塊出現(xiàn)了類似血管瘤的組織學(xué)表現(xiàn)。該現(xiàn)象的機(jī)制目前還不十分清楚，分析可能是植入細(xì)胞表達(dá)過(guò)多的VEGF和BMP4，兩者的共同作用誘發(fā)體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞惡性增殖和分化而形成的血管瘤組織。

綜上所述，骨骼肌源性細(xì)胞作為BMP4基因治療的基礎(chǔ)細(xì)胞，用來(lái)在體內(nèi)誘導(dǎo)新生骨組織形成是可行的，而在增加了VEGF 和sFlt1基因的多基因治療后，2組肌源性細(xì)胞的表現(xiàn)不盡相同。但是過(guò)多的VEGF會(huì)抑制新骨的形成，甚至產(chǎn)生不良的后果。

致謝：該課題在選題及研究過(guò)程中得到國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目資助，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及開展得到鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和骨科各位專家教授的指導(dǎo)與幫助。

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(2015-01-24 收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

Investigation of endochondral bone formation induced by mouse myogenic cells based on retrovirus containing BMP4,VEGF， and sFlt1 genes therapy

LIYi,LIUGuanlei,TANGHaojie,ZHANGBao,YUANHongtao,XUJianzhong,LIGuangheng

DepartmentofOrthopaedicSurgery,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

myogenic cell;gene therapy;bone morphogenetic protein 4;vascular endothelial growth factor;mouse

Aim: To investigate the effect of VEGF and sFlt1 on the ectopic bone formation induced by myogenic cells based on Retro-BMP4 gene therapy. Methods: C2C12 and PM cells were used in this study. The cells were transduced with Retro-BMP4, combination of Retro-BMP4 and Retro-VEGF, combination of Retro-BMP4 and Retro-sFlt1, respectively. When transduced cells were ready, they were implanted into the skeletal muscle pocket of SCID mice hind leg with gelfoam. Histological and imaging examination which included X-ray were used to evaluate the process of ectopic bone formation.Results: Both C2C12-B-sFlt1 and C2C12-B cells were able to induce the ectopic endochondral bone formation in the muscle pocket. There was no difference between the two groups regarding to the amount of bone tissues. The only difference between the two groups was the three dimensional orientation of new bone tissues under the examination of X-ray. C2C12-B-VEGF group did not induce any bone formation in the muscle pocket. Histological results showed that this group produced the neoplasm which was more like hemangioma tissue. Three groups including PM-B-sFlt1,PM-B,PM-B-VEGF induced similar process of ectopic endochondral bone formation. There was no difference among three cell groups regarding to the amount of bone tissues during the 35 days observation. Conclusion: Myogenic cells isolated from skeletal muscle could be used as the cell source for BMP4 gene therapy. When the VEGF and sFlt1 genes are added in the process, the process of ectopic endochondral bone formation displays individual cell-based characteristics.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.002

*國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 81472136

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