碘試液比色法測定α—淀粉酶抑制劑活性

謝雨杉　李多偉　李銀芳　等

摘要：建立α-淀粉酶抑制劑活性的碘試液比色測定方法，對淀粉基質(zhì)液濃度、反應(yīng)溫度系列試驗(yàn)條件進(jìn)行確定。結(jié)果顯示，最佳測定條件為淀粉基質(zhì)液濃度為2.5%，酶促反應(yīng)的最適溫度40 ℃，平均回收率為99.03%（n=6），精密度RSD=1.82%?？梢?，該測定方法簡便、快捷、重復(fù)性良好，可作為α-淀粉酶抑制劑活性的常規(guī)測定方法。

關(guān)鍵詞：白蕓豆；碘試液比色法；α-淀粉酶抑制劑活性

中圖分類號： TS201.2+5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0301-02

收稿日期：2014-04-03

作者簡介：謝雨杉（1989—），女，福建福州人，碩士研究生，主要從事天然藥物提取與分離及應(yīng)用研究。E-mail：122513527@qq.com。

通信作者：李多偉，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然動植物資源提取、分離與植物細(xì)胞工程研究。E-mail：duoweili@163.com。α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，簡稱α-AI）屬于糖苷水解酶。胃腸道內(nèi)唾液胰淀粉酶的活性能被α-AI有效抑制，人體對食物中主要碳水化合物的水解和消化受到阻礙或延緩，降低了食物中淀粉糖類物質(zhì)的分解吸收，起到了降低血糖、血脂作用并抑制了血糖濃度的升高，在糖尿病患者的飲食治療中起到了很好的作用；α-AI可減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化，延緩腸道排空，增加脂肪消耗，對肥胖患者減輕體質(zhì)量也起到了很好的作用。因此，α-AI可以用來防治糖尿病、動脈硬化癥、高血脂、脂肪過多癥及肥胖癥[1-2]。從白蕓豆中獲得α-AI具有高效價及耐熱性而倍受關(guān)注[3]。

α-AI能特異性抑制α-淀粉酶，從而減少α-淀粉酶對淀粉的水解，碘試液與淀粉呈藍(lán)色反應(yīng)，并在一定波長下有最大吸光度。通過定量測定添加抑制劑前后淀粉量的變化可測得α-AI的活性[4]。本研究對碘試液比色法測定α-淀粉酶抑制劑活性的試驗(yàn)條件進(jìn)行系列試驗(yàn)，以期尋找最佳試驗(yàn)條件，為α-AI的科學(xué)研究和生產(chǎn)檢測提供可借鑒的參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1儀器

德國賽多利斯ME235S-電子分析天平；上海醫(yī)療器械五廠H·H·S21-6C電熱恒溫水浴鍋；上海博迅公司THZ-92A 恒溫振蕩器；上海大龍醫(yī)療器械有限公司PotPette 100～1 000 μL 手動單道可調(diào)式移液器；日本島津UV-1700紫外可見光分光光度計(jì)等。

1.2試劑

1.2.10.2 mol/L 乙酸鹽緩沖液（pH值 5.6）的配制取0.2 mol/L 乙酸溶液90 mL，0.2 mol/L乙酸鈉溶液910 mL，混勻即為0.2 mol/L乙酸鹽緩沖液（pH值 5.6） 。其中，0.2 mol/L 乙酸溶液配制：吸取11.8 mL乙酸用蒸餾水定容至1 000 mL； 0.2 mol/L 乙酸鈉溶液配制：稱取27.22 g乙酸鈉用蒸餾水溶解，定容至1 000 mL。

1.2.2碘試液的配制稱取0.317 g碘溶于4 mL 25%碘化鉀溶液中，加蒸餾水至200 mL，取10 mL加入至25 mL 25%鹽酸中，再用水稀釋至500 mL。

1.2.31.5%可溶性淀粉溶液的配制準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥4 h的可溶性淀粉3.0 g，加20 mL蒸餾水使成混懸液，然后緩緩倒入約100 mL沸水中，溶解后煮沸至清亮透明，放冷，加40 mL 0.2 mol/L 乙酸鹽緩沖液（pH值 5.6），用蒸餾水稀釋至 200 mL。

1.2.4淀粉基質(zhì)液的配制10 mL 1.5%可溶性淀粉加1 mL蒸餾水混合，取其0.1 mL于10 mL碘試液中，立即混合后于波長620 nm處測定吸光度，取吸光度為0.9～1.0的1.5%可溶性淀粉溶液作為淀粉基質(zhì)液。

1.2.5酶稀釋液的配制1.641 g乙酸鈉、0.176 g乙酸鈣及5.84 g氯化鈉溶于約800 mL蒸餾水中，用1 mol/L乙酸調(diào)至pH值為6.0后加蒸餾水至1 000 mL。

1.2.6α-淀粉酶試樣溶液的配制準(zhǔn)確稱取0.5 g α-淀粉酶（購于北京奧特星生物技術(shù)有限責(zé)任公司），加酶稀釋液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中懸保溫2 h后備用。用下述活性測定法進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，試驗(yàn)溶液的藍(lán)色全部消失并變?yōu)榧t色時作為試樣溶液。

1.2.7α-AI試樣溶液的配制用以下方法從白蕓豆中提取供試品α-AI[5]：白蕓豆→粉碎→水浸提→硫酸銨鹽析→透析→濃縮→干燥→產(chǎn)品（灰白色粉未狀）。準(zhǔn)確稱取 0.5 g α-AI試樣，加酶稀釋液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中保溫2 h后備用。

2結(jié)果與分析

2.1測定條件的選擇

2.1.1淀粉基質(zhì)液濃度的確定配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%系列可溶性淀粉溶液，分別取10 mL于各試管中，再各加1 mL蒸餾水混合，取其0.1 mL于10 mL碘試液中，立即混合后于波長620 nm處測定吸光度，并作為淀粉基質(zhì)液進(jìn)行活性測定，觀察在波長620 nm處試驗(yàn)溶液的藍(lán)色消失并變?yōu)榧t色時管數(shù)。確定淀粉基質(zhì)液的濃度。

從表1可以看出，淀粉基質(zhì)液濃度在2.0%及以下時，由于淀粉少、相對酶量大，待反應(yīng)6 min后觀察時幾乎看不到藍(lán)色消失而直接是淺紅色；而淀粉基質(zhì)液濃度在3.0%及以上時，由于淀粉多、相對酶量少，待反應(yīng)6 min后觀察至20 min時仍未見藍(lán)色消失的跡象；淀粉基質(zhì)液濃度在2.5%時，待反應(yīng) 6 min 后，7～20 min內(nèi)可觀察到藍(lán)色消失轉(zhuǎn)變?yōu)闇\紅色的過程。因此，淀粉基質(zhì)液濃度確定為2.5%。

表1淀粉基質(zhì)液濃度的確定

濃度

（%）取液量endprint

（mL）加水量

（mL）吸光度管數(shù)結(jié)果0.51010.1～0.3第1管無法觀察1.01010.3～0.5第1管無法觀察1.51010.5～0.7第1管無法觀察2.01010.7～0.9第1管無法觀察2.51010.9～1.0第2管至第15管可觀察到3.01011.0～1.215管以后無法觀察注：n=5。

2.1.2反應(yīng)溫度的確定取10 mL基質(zhì)液于25 mL容量瓶中，分別在20、30、40、50、60 ℃恒溫振蕩器內(nèi)振搖15 min后，準(zhǔn)確加入1 mL α-淀粉酶試樣溶液，立即振搖混勻后放回相應(yīng)溫度振蕩器內(nèi)繼續(xù)振搖。從計(jì)時反應(yīng)6 min后開始每過 1 min 取出0.1 mL于10 mL碘試液中，立即混合并作為試驗(yàn)溶液。于波長620 nm處測定試驗(yàn)溶液的藍(lán)色消失并變?yōu)榧t色時的管數(shù)，確定酶促反應(yīng)的最適溫度。從表2可以看出，20、60 ℃時由于不是酶促反應(yīng)最適溫度，第30管以后仍無法觀察到藍(lán)色消失；30、50 ℃時雖接近酶促反應(yīng)最適溫度，但不是最適溫度，在第20管至第30管可觀察到藍(lán)色消失，但時間過長不利于檢測；40 ℃時是酶促反應(yīng)的最適溫度，在第2管至第20管可觀察到藍(lán)色消失，能滿足檢測觀察的需要。

表2酶促反應(yīng)最適溫度的確定

溫度（℃）管數(shù)結(jié)果20第30管以后無法觀察30第20管至第30管可觀察到40第2管至第20管可觀察到50第20管至第30管可觀察到60第30管以后無法觀察注：n=5。

2.2α-淀粉酶抑制劑活性的碘試液比色測定方法

按照上述確定的最佳基質(zhì)液濃度、反應(yīng)溫度，對分離純化的白蕓豆α-AI進(jìn)行活性測定。

2.2.1α-淀粉酶活性的測定取10 mL基質(zhì)液于25 mL容量瓶中，40 ℃恒溫振蕩器內(nèi)振搖15 min后準(zhǔn)確加入1 mL α-淀粉酶試樣溶液，立即振搖混勻后放回40 ℃振蕩器內(nèi)繼續(xù)振搖。從計(jì)時反應(yīng)6 min后開始每過1 min取出0.1 mL于 10 mL 碘試液中，立即混合并作為試驗(yàn)溶液。于波長620 nm處測定試驗(yàn)溶液的藍(lán)色消失并變?yōu)榧t色時的吸光度Dt。用 1 mL 水代替試樣溶液作為空白試驗(yàn)溶液，與試驗(yàn)溶液同樣操作，測定吸光度Db。求酶活性。

2.2.2α-AI活性的測定精確吸取α-AI 1.0 mL與α-淀粉酶溶液1.0 mL于試管中，充分搖勻后在40 ℃恒溫振蕩器內(nèi)反應(yīng)15 min，同時另取10 mL基質(zhì)液于25 mL容量瓶中，于40 ℃恒溫振蕩器內(nèi)振搖15 min后，準(zhǔn)確加入1 mL上述反應(yīng)液，立即振搖混勻后放回40 ℃振蕩器內(nèi)繼續(xù)振搖。從計(jì)時反應(yīng)6 min后開始每過1 min取出0.1 mL于10 mL碘試液中，立即混合并作為試驗(yàn)溶液。于波長620 nm處測定試驗(yàn)溶液的藍(lán)色消失并變?yōu)榧t色時的吸光度Dt。用1 mL水代替反應(yīng)液作為空白試驗(yàn)溶液，與反應(yīng)液同樣操作，測定吸光度Db。求酶活性。

2.2.3酶活性計(jì)算酶活性單位以1 g酶在1 min內(nèi)基質(zhì)液中藍(lán)色的碘減少10%時為1 U/g。

α-淀粉酶活性（U/g）=（Db-Dt）/Db×（100/10）×（1/t）×（1/m）。

式中：t為反應(yīng)時間（min）；m為1 mL試樣溶液中酶的質(zhì)量（g），α-淀粉酶抑制劑活性（U/g）=抑制前α-淀粉酶活性-抑制后α-淀粉酶活性。

2.3精密度測定

取試驗(yàn)分離純化的白蕓豆α-AI樣品，精確稱取，按照“2.2”節(jié) α-淀粉酶抑制劑活性的碘試液比色測定方法進(jìn)行測定，6次連續(xù)重復(fù)測定，試驗(yàn)結(jié)果表明，該比色測定方法測定α-AI有良好的精密度，RSD=1.82%（n=6）。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次試驗(yàn)分離純化的白蕓豆α-AI樣品，精確稱取6份，按照“2.2”節(jié) α-淀粉酶抑制劑活性的碘試液比色測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果表明，該比色測定方法有良好的重復(fù)性，RSD=2.12%（n=6）。

2.5加樣回收率試驗(yàn)

從已知α-AI活性的樣品溶液中精密吸取300 μL，共6份，分別準(zhǔn)確加入α-AI對照品溶液200 μL，按照“2.2”節(jié) α-淀粉酶抑制劑活性的碘試液比色測定方法進(jìn)行測定，測加入量的回收率。從表3得出，α-AI平均回收率為99.03%（n=6）。

表3α-AI加樣回收率試驗(yàn)（n=3）

濃度

（%）α-AI活性（U/g）樣品對照品實(shí)測對照品回收率

（%）RSD

（%）11 2083 6384 80298.792.0221 2203 6824 83598.181.9431 1953 6574 853100.031.9741 2133 6624 84899.262.1051 2093 6494 81798.881.9361 2163 6554 83699.041.95注：n=3。

3結(jié)論

通過對淀粉基質(zhì)液濃度、反應(yīng)溫度系列試驗(yàn)條件的研究，確定α-AI的碘試液比色測定方法的最佳試驗(yàn)條件為：淀粉基質(zhì)液濃度2.5%，酶促反應(yīng)的最適溫度40 ℃。此方法精密度為RSD=1.82%，平均回收率為99.03%（n=6）?？梢?，該檢測方法簡便、快捷、重復(fù)性好，可用于α-AI活性的常規(guī)測定。

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