腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纖維化模型

魏曉光， 郭 輝， 陳永珍， 張于娟

(1. 蘇州大學(xué) a. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院；b. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心，江蘇 蘇州 215123；2. 江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214064)

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腹腔注射四氯化碳建立大鼠肝纖維化模型

魏曉光1a， 郭 輝2， 陳永珍1a， 張于娟1b

(1. 蘇州大學(xué) a. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院；b. 蘇州大學(xué) 醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)中心，江蘇 蘇州 215123；2. 江南大學(xué) 無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫 214064)

腹腔注射四氯化碳(Carbon Tetrachloride, CCl4)構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，追蹤觀察模型大鼠病理組織學(xué)改變，為臨床研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。模型組雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠按1.0 ml/kg劑量腹腔注射40% CCl4-橄欖油混懸液，每周3次，共計(jì)8周；對照組同時(shí)腹腔注射等量的生理鹽水。于給藥1～4、6、8周末每組隨機(jī)取6只大鼠肝臟，肉眼觀察肝臟組織大體改變，經(jīng)HE和Masson染色觀察肝臟病理學(xué)改變。肝臟組織光鏡下顯示：模型組給藥第2周肝細(xì)胞發(fā)生脂肪變性；第4周肝組織局部形成假小葉，門管區(qū)有大量纖維細(xì)胞聚集；第6～8周肝組織出現(xiàn)大面積假小葉，建模成功率高達(dá)88.3%。采用多點(diǎn)、密集的腹腔注射方法可更有效地建立大鼠肝纖維化模型, 為臨床提供可靠的研究模型。

四氯化碳； 肝纖維化； 大鼠； 模型

0 引 言

肝纖維化是肝臟對各種慢性肝損傷的代償反應(yīng)，是由于持續(xù)性肝損傷造成肝細(xì)胞持續(xù)壞死，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞群和細(xì)胞因子復(fù)雜改變，導(dǎo)致過多膠原在肝內(nèi)沉積所致，常伴有炎癥并可發(fā)展為肝硬化[1-2]。根據(jù)肝纖維化病因建立動(dòng)物模型來研究其發(fā)病機(jī)制，能為其預(yù)防和治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[3]。CCl4構(gòu)造肝纖維化動(dòng)物模型是經(jīng)典的研究方法，并最早、最廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性肝纖維化研究。因?qū)嶒?yàn)方法和條件差異缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，如CCl4劑量和給藥方式的不同，往往造成模型建立所需時(shí)間較長和成功率偏低[4-6]。本實(shí)驗(yàn)擬采用新劑量和多點(diǎn)、較密集的腹腔注射CCl4方式建立大鼠肝纖維化動(dòng)物模型，運(yùn)用HE和Masson染色來追蹤肝纖維化發(fā)病進(jìn)程，尋求一種快速、可靠、高效的肝纖維化動(dòng)物模型建立方法。

1 動(dòng)物模型建立

(1) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠90只，質(zhì)量200～300 g，由蘇州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)研究中心提供。

(2) 動(dòng)物分組及造模。選用SD雄性大鼠90只，隨機(jī)選擇30只作為對照組，余下為模型組。模型組按1.0 ml/kg 腹腔注射40% CCl4-橄欖油混懸液，每周3次，共計(jì)8周，對照組同時(shí)腹腔注射等量的生理鹽水。模型組于給藥1周末隨機(jī)取6只大鼠，對照組5只大鼠。稱量兩組大鼠體重，25%烏拉坦麻醉后取出肝臟于10%甲醛中固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。模型組和對照組在2、3、4、6、8周末采取同第1周末的處理方法。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)大鼠一般狀態(tài)

對照組大鼠毛色有光澤，飲食飲水正常，體質(zhì)量逐漸增加，生長發(fā)育狀態(tài)良好且無死亡。模型組大鼠每次給藥后情緒萎靡，煩躁不安。隨給藥時(shí)間的延長飲水減少，食欲下降，活動(dòng)減少，皮毛蓬亂無光，體質(zhì)重減輕。給藥3周后開始出現(xiàn)死亡。

2.2 肝纖維化模型成功率

83只大鼠建模成功，成功率88.3%。對照組和模型組大鼠前2周均成活。模型組第3周死亡1例，建模成功率90%；第4周1例，成功率90%；第6周2例，成功率80%；第8周3例，成功率70%；模型組大鼠的成活率是88.3%(見表1)。模型組大鼠死亡率隨給藥時(shí)間延長呈上升趨勢，實(shí)驗(yàn)中死亡大鼠肛門處有大量污穢，腹部腫脹、變硬，剖腹可見腹腔嚴(yán)重腹水，肝臟腫脹，表面包裹白色薄膜，似慢性中毒死亡。

2.3 病理學(xué)改變

2.3.1 大體改變

對照組：大鼠肝臟呈紅褐色，有光澤，質(zhì)地較軟，邊緣銳利，表面光滑細(xì)膩(圖1(a))。模型組：給藥第1周大鼠肝臟大體正常(圖1(b))；第2周大鼠肝臟充血呈暗紅色，表面尚光滑且有少量脂肪覆蓋(圖1(c))；第3周大鼠肝臟呈淡黃色并與膈肌粘連，質(zhì)地較硬，邊緣圓鈍(圖1(d))；第4周肝臟顏色發(fā)黃，表面凹陷(圖1(e))；第6周大鼠腹腔內(nèi)有少量腹水，肝臟顏色變?yōu)榛野咨遗c周圍組織嚴(yán)重黏連，表面皺縮并出現(xiàn)堅(jiān)硬小結(jié)節(jié)(圖1(f))；第8周時(shí)腹腔內(nèi)出現(xiàn)較嚴(yán)重肝腹水，肝臟表面出現(xiàn)大量小結(jié)節(jié)或顆粒，質(zhì)地硬，切面可見肝臟正常結(jié)構(gòu)被島嶼狀結(jié)節(jié)代替，結(jié)節(jié)周圍有灰白色結(jié)締組織間隔包繞(圖1(g))。

表1 實(shí)驗(yàn)過程中兩組大鼠死亡情況

圖1 對照組和模型組大鼠肝臟病理學(xué)大體改變

(a)對照組，(b)模型組第1周，(c)模型組第2周，(d)模型組第3周，(e)模型組第4周，(f)模型組第6周，(g)模型組第8周

2.3.2 HE染色

肝組織HE染色光鏡顯示： 對照組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)正常，界限清晰；中央靜脈旁有放射狀排列的肝細(xì)胞索，肝細(xì)胞體積較大，胞漿豐富；匯管區(qū)結(jié)構(gòu)清晰(圖2(a))。模型組隨造模時(shí)間延長，肝纖維化程度逐漸加重，第1～2周肝小葉結(jié)構(gòu)可辨，肝竇擴(kuò)張淤血，中央靜脈周圍部分肝細(xì)胞出現(xiàn)輕度脂肪變，部分匯管區(qū)結(jié)締組織增生(圖2(b)、(c))。第3周肝索排列紊亂，肝竇狹窄，大部分肝細(xì)胞腫大，脂肪變細(xì)胞中出現(xiàn)大小不等球形脂滴(圖2(d))。第4周時(shí)，中央靜脈淤血明顯，肝組織病變區(qū)域多，面積大，正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞索排列紊亂，中央靜脈周圍及匯管區(qū)膠原纖維與網(wǎng)狀纖維沉積形成纖維間隔，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂(圖2(e))。第6～8周時(shí)，肝組織內(nèi)假小葉廣泛形成并出現(xiàn)肝細(xì)胞不同程度的變性、壞死(圖2(f)、(g))。

圖2 對照組和模型組肝臟組織HE染色

(a)正常(400×)，(b)模型組第1周(400×)，(c)模型組第2周(400×)，(d)模型組第3周(100×)，(e)模型組第4周(100×)，(f)模型組第6周(40×)，(g)模型組第8周(40×)

2.3.3 Masson染色

肝組織Masson染色光鏡顯示：正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊；注射CCl4第1周，近中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈少量脂肪變性(圖3(a),(b))。第2周開始出現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，并有少量膠原纖維生成(圖3(c))。第3周出現(xiàn)大面積的肝細(xì)胞脂肪變性，膠原纖維數(shù)量增多(圖3(d))。第4周出現(xiàn)明顯膠原纖維沉積(圖3(e))。第6周出現(xiàn)膠原纖維沉積和形成明顯的假小葉(圖3(f))。第8肝臟膠原纖維逐漸增加連接成小葉間隔，形成大量的假小葉(圖3(g))。

3 討 論

目前，國內(nèi)外利用CCl4建立肝纖維化模型的造模途徑有皮下注射、腹腔注射、灌胃和蒸氣吸入等方法[7-9]。皮下注射造模周期長，動(dòng)物死亡率高，更重要的是操作不當(dāng)會(huì)發(fā)生皮下滲漏；灌胃法造模時(shí)間長，且個(gè)體差異較大，大多數(shù)大鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束前已死亡；蒸氣吸入法較復(fù)雜且容易引起肝外病變。經(jīng)過比較，我們認(rèn)為利用CCl4腹腔注射制備肝纖維化模型具有皮下注射、灌胃、蒸氣吸入造模所不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：快速高效、操作簡便、病理結(jié)果可靠，不易外漏。

通過查閱文獻(xiàn)[10-12]，預(yù)實(shí)驗(yàn)遴選40% CCl4-橄欖油懸浮液以首次劑量5.0 ml/kg的劑量注射，結(jié)果大部分大鼠急性 CCl4中毒而死亡。CCl4進(jìn)入體內(nèi)15 min即可引起肝細(xì)胞損傷，至48 h 達(dá)到高峰，隨后進(jìn)入修復(fù)階段。因此可采用間隔3～4 d 注藥1次，即在一次染毒造成肝損害后的修復(fù)期再次給藥，重復(fù)“損害—修復(fù)—損害”的過程誘導(dǎo)肝纖維化。本方法采用多點(diǎn)，較密集的1.0 ml/kg劑量注射，每周3次，共計(jì)8周。實(shí)驗(yàn)選擇雄性大鼠的原因是不同性別的肝臟組織雌激素受體表達(dá)不同。研究顯示，女性肝臟雌激素受體含量是男性的3倍，這可能是造成肝纖維化性別差異的原因所在[13]。所得大鼠肝纖維化模型組織病理特點(diǎn)與肝纖維化病理改變相似，通過觀察CCl4誘發(fā)大鼠肝纖維化不同時(shí)段肝臟大體形態(tài)和病理組織學(xué)結(jié)果可明顯看出各模型組的區(qū)別。隨給藥時(shí)間延長肝纖維化程度增加，成功建立肝纖維化模型，符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的預(yù)期結(jié)果。該模型既可有效形成肝纖維化且橄欖油過多沉積造成脂肪堆積，與臨床病人肝纖維化多伴有高脂飲食相接近，建模成功率高達(dá)88.3%。

圖3 對照組和模型組肝臟組織Masson三色染色(40×)

(a)正常，(b)模型組第1周，(c)模型組第2周，(d)模型組第3周，(e)模型組第4周，(f)模型組第6周，(g)模型組第8周

4 結(jié) 語

如何建立一種理想的肝纖維化動(dòng)物模型，一直是實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。一個(gè)理想的肝纖維化動(dòng)物模型應(yīng)該符合以下條件：①與人類肝纖維化疾病的基本病變特征相似；②病變有一定發(fā)展過程，以及病程存在可逆與不可逆的階段性演進(jìn)過程；③形成率高，死亡率低，重復(fù)性好；④造模方法簡便易行和動(dòng)物易獲得，經(jīng)濟(jì)實(shí)用[14-16]。本實(shí)驗(yàn)采用小劑量，多次重復(fù)在一次染毒造成肝損害后的修復(fù)期再次給藥的方法，縮短造模周期，降低大鼠死亡率，快速成功地建立CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型，是一個(gè)較為理想的肝纖維化動(dòng)物模型。

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Studies on Rats Hepatic Fibrosis Model Established by Intraperitoneal Injection of Carbon Tetrachloride

WEIXiao-guang1a,GUOHui2,CHENYong-zhen1a,ZHANGYu-Juan1b

(1a. School of Biology and Basic Medical Sciences; 1b. Experimental Center of Medical College, Soochow University, Suzhou 215123, China; 2. Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214064, China)

To establish rat liver fibrosis model, CCl4solution was injected intraperitoneally and the pathological changes were observed. The result can offer fibrosis model for clinical studies. The authors use SD male rats as model group, and they were injected 40% CCl4-olive oil solution, and the control group was injected saline, intraperitoneally three times a week for 8 weeks. At the end of the 1st, 2nd, 3rd, 4th, 6th, and 8th weeks, 6 rats from each group were randomly selected to demonstrate HE and Masson staining and observe the liver pathological changes. Hepatic steatosis was observed under the microscopy after CCl4-olive oil administration for 2 weeks in model group. After 4 weeks, some pseudolobules formed and numerous fibroblasts assembled at the portal area. At six to eight weeks, numerous liver pseudolobules appeared. The rate of success modeling is up to 88.3%. Hence, multi-point and intensive intraperitoneal injection method can be more effective to rat liver fibrosis model, which is reliable for clinical research.

carbon tetrachloride (CCl4); liver fibrosis; rats; model

2015-01-30

魏曉光(1988-)，男，河南周口人，碩士生，主要研究方向?yàn)楦卫w維化。Tel.: 18896500285; E-mail: wxg163361@163.com

張于娟(1979-),女，江蘇丹陽人，博士，主要方向肝細(xì)胞及胎源性疾病。

Tel.: 13771922996；E-mail: zhangyujuan@suda.edu.cn

R-331

A

1006-7167(2015)11-0034-04