骨形成蛋白3在肝門部膽管癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

李 勛， 湯 地， 周 奇， 王寰昱， 陳健聰， 朱曉旭， 殷曉煜， 梁力建

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

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骨形成蛋白3在肝門部膽管癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

李 勛， 湯 地△， 周 奇， 王寰昱， 陳健聰， 朱曉旭， 殷曉煜， 梁力建

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院肝膽外科，廣東 廣州 510080)

目的： 探討肝門部膽管癌組織中骨形成蛋白3(BMP3)的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：收集30例肝門部膽管癌的臨床標(biāo)本，應(yīng)用real-time PCR和Western blot檢測(cè)BMP3 mRNA 和蛋白在癌組織和癌旁組織的相對(duì)表達(dá)情況。收集103例肝門部膽管癌石蠟標(biāo)本，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤組織中BMP3蛋白的表達(dá)，并分析其與臨床病理的關(guān)系。結(jié)果：全組30例肝門部膽管癌組織中，22例癌組織BMP3蛋白和mRNA的表達(dá)水平較癌旁組織明顯下降。免疫組織化學(xué)方法顯示103例肝門部膽管癌組織中，87例陰性，16例弱陽(yáng)性，BMP3蛋白的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度密切相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論：肝門部膽管癌組織中BMP3基因處于抑制狀態(tài)，其表達(dá)的下調(diào)可能與肝門部膽管癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

肝門部膽管癌； 骨形成蛋白3

骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是從骨基質(zhì)分離提純的一類具有高效誘導(dǎo)骨、骨軟骨形成的酸性糖蛋白。除 BMP1 外其余均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族[1]。既往研究表明 BMPs 蛋白參與體內(nèi)多種重要的生物學(xué)過(guò)程，BMP 蛋白的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-3]。雖然已有大量研究探討了 BMP 家族成員在腫瘤形成中的作用，如 BMP2、BMP4和BMP7等[3-5]，但是BMP3在癌癥中作用的研究仍然很少。本研究旨在檢測(cè)BMP3在肝門部膽管癌組織中的表達(dá)，并探討其臨床意義。

材 料 和 方 法

1 一般資料

選取中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2013年1月～2014年8月期間手術(shù)切除的肝門部膽管癌組織及其癌旁組織標(biāo)本30例，其中男性18例，女性12例，年齡32～81歲，平均年齡58.2歲。所有標(biāo)本均于離體30 min內(nèi)切成0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm大小，并置于液氮中迅速冷凍，后于-80 ℃保存。癌旁組織取距離腫瘤邊緣1 cm處的膽管組織。收集中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院2003年1月～2013年1月期間手術(shù)切除的肝門部膽管癌石蠟標(biāo)本103例，其中男性63例，女性40例，年齡36～75歲，平均年齡56.7歲。腫瘤直徑為1～5 cm，平均為2.43 cm，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36例，全組無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。Bismuth-Corlette分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期25例，ⅢA期24例，ⅢB期23例，Ⅳ期21例。MSKCC分期為T1期65例，T2期25例，T3期13例。AJCC-7版腫瘤TNM分期為Ⅰ期10例，Ⅱ期55例，ⅢA期2例，ⅢB期21例，Ⅳ期15例。所有病例均經(jīng)過(guò)術(shù)后病理證實(shí)，且術(shù)前未進(jìn)行放、化療。

2 方法

2.1 Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 將30例新鮮手術(shù)標(biāo)本組織剪成小塊，在液氮中磨成粉末，稱取100 mg組織加入1 mL Trizol(Invitrogen)，根據(jù)說(shuō)明抽提總RNA。用NanoDrop 2000(Thermo)測(cè)定RNA濃度，RNA純度為1.8～2.0時(shí)，采用TOYOBO ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒(TOYOBO)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR采用Applied Biosystems power SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒(Life Technologies)，根據(jù)說(shuō)明在ABI 7500中操作完成。反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。BMP3的上游引物序列為5’-CCCAAGTCCTTTGATGCCTA-3’，下游引物序列為5’-TGGTACACAGCAAGGCTCAG-3’；β-actin 的上游引物序列為5’-ACAATGTGGCCGAGGACTTT-3’，下游引物序列為5’-GGAGAGGACTGGGCCATTCT-3’。結(jié)果以β-actin為內(nèi)參照。BMP3的mRNA表達(dá)量以2-ΔΔCt值計(jì)算。BMP3的ΔCt值=BMP3 Ct值-β-actin Ct值；BMP3的ΔΔCt值=腫瘤BMP3的ΔCt值-癌旁BMP3的ΔCt值。

2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 將30例新鮮手術(shù)標(biāo)本組織剪碎液氮中研磨，加入RIPA裂解液(含1% PMSF)(中國(guó)鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)提取腫瘤組織和癌旁組織的總蛋白，BCA試劑盒(中國(guó)鼎國(guó)生物科技有限公司)檢測(cè)蛋白濃度，取40 μg的蛋白上樣量通過(guò)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，以25 mV、0.4 mA、45 min的半干轉(zhuǎn)條件將目的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45 nm的NC膜(PALL)，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入BMP3抗體(1∶200稀釋，Abcam)和β-actin抗體(1∶10 000稀釋，中國(guó)武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，4 ℃冰上搖床過(guò)夜。TBST洗膜3次后，予以熒光兔抗和鼠抗(1∶10 000，LI-COR)室溫避光孵育1 h。TBST洗膜3次后，于Oddesy雙色紅外激光成像系統(tǒng)(LI-COR)掃膜成像。

2.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 將石蠟標(biāo)本以4 μm厚切片，經(jīng)過(guò)二甲苯、梯度乙醇脫蠟脫水后，于檸檬酸鹽緩沖液中行微波抗原修復(fù)20 min。待冷卻至室溫后，予以3%雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30 min。山羊血清封閉30 min后滴加BMP3抗體(1∶50稀釋)覆蓋組織，濕盒內(nèi)放置4 ℃過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫1h，滴加 II 抗(鼠/兔通用型 II 抗，Dako)30 min，顯微鏡下DAB顯色(1∶50稀釋，Dako)，蘇木素復(fù)染1 min，流水沖洗10 min，梯度乙醇二甲苯脫水后，中性樹膠封片。結(jié)果評(píng)定根據(jù)染色強(qiáng)度：0分(陰性)，1分(弱陽(yáng)性)，2分(中等陽(yáng)性)，3分(強(qiáng)陽(yáng)性)；陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0分(≤5%)，1分(6%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。染色強(qiáng)度得分乘以陽(yáng)性細(xì)胞的得分為每張切片的免疫反應(yīng)評(píng)分，0～1分為陰性，2～4分為弱陽(yáng)性，5～7分為強(qiáng)陽(yáng)性。每例標(biāo)本由兩位病理學(xué)專家分別評(píng)定后再進(jìn)行討論，直到達(dá)成一致。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。

結(jié) 果

1 BMP3的mRNA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，30例樣本中，有22例癌組織的BMP3表達(dá)明顯低于癌旁組織，3例癌組織與癌旁組織的差異不明顯，5例癌組織中BMP3的表達(dá)高于癌旁組織。其中癌組織中BMP3的mRNA平均相對(duì)表達(dá)量為0.58±0.29，癌旁組織中BMP3的mRNA平均相對(duì)表達(dá)量為0.99±0.04，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

Figure 1.The mRNA expression of BMP3 in the tumor and para-cancerous tissues. The expression level of BMP3 mRNA in the tumor tissues was significantly lower than that in the parcancerous tissues (P<0.01). The mRNA levels were normalized to β-actin.

圖1 BMP3 mRNA 在腫瘤組織和癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)情況

2 BMP3蛋白在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，30例樣本中，22例患者腫瘤中的BMP3蛋白的表達(dá)水平較癌旁組織明顯降低，其表達(dá)情況與BMP3的mRNA表達(dá)一致。8例患者腫瘤中BMP3蛋白的表達(dá)水平與癌旁組織差異不明顯,見圖2。

Figure 2.The protein expression of BMP3 in the tumor and para-cancerous tissues. A: representative Western blots showing that BMP3 protein expression in the tumor tissues was significantly lower than that in the paracan-cerous tissues (n=22); B: representative Western blots showing that BMP3 protein expression in tumor and parcancerous tissues had no significant difference (n=8). T: tumor tissues; P: parcancerous tissues.

圖2 BMP3蛋白在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

3 BMP3蛋白表達(dá)水平與臨床病理的關(guān)系

對(duì)103例肝門部膽管癌樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果顯示全組腫瘤組織中BMP3蛋白均無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，16例弱陽(yáng)性表達(dá)，87例陰性表達(dá)(圖3)。

BMP3蛋白的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度密切相關(guān)(P<0.05)，見表1。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中BMP3蛋白的表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，AJCC-7版腫瘤TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期患者的BMP3蛋白的表達(dá)水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期的患者。且腫瘤的惡性程度越高，分化程度越低，BMP3蛋白的表達(dá)量越低。而BMP3蛋白的表達(dá)與腫瘤Bismuth-Corlette分期、MSKCC分期、患者的年齡、性別、腫瘤直徑、血清中CA199、CA125和CEA的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。

Figure 3.Representative immunohistochemical photomicrographs showing the expression of BMP3 in the tumor tissues and the para-cancerous tissues (×400). A: adjacent normal liver tissue (strong positive); B: poorly differentiated tumor tissue (negative); C: moderately differentiated tumor tissue (negative); D: well-differentiated tumor tissue (weak positive).

圖3 BMP3蛋白在肝門部膽管癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況

討 論

膽管癌是膽道系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，是第二大原發(fā)性肝臟腫瘤，占肝臟惡性腫瘤的5%～30%，僅次于肝細(xì)胞癌[6]。近年來(lái)的臨床流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，膽管癌的發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，其增長(zhǎng)速度已經(jīng)超過(guò)了肝細(xì)胞癌[7]。大量臨床研究表明：膽管癌惡性程度高，病死率高，姑息性治療患者的中位生存時(shí)間僅為6個(gè)月，手術(shù)治療能延長(zhǎng)術(shù)后中位生存時(shí)間至2年，但5年生存率仍較低，約20%[8]。因此，深入了解膽管癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，探討新的可能治療的靶點(diǎn)和新的診斷指標(biāo)十分必要。

BMP家族成員是一類在體內(nèi)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要生物學(xué)作用的蛋白家族[2]。近年的研究表明BMP蛋白的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但BMP家族在腫瘤中扮演的角色卻是多重的。BMP多數(shù)情況下可以抑制腫瘤的發(fā)生，但在少數(shù)的癌癥中其發(fā)揮促進(jìn)癌癥形成的作用，盡管同一基因在不同的腫瘤的發(fā)生發(fā)展中亦可能發(fā)揮截然相反的作用。已有的研究證實(shí)BMP2可以通過(guò)抑制Smad通路從而抑制胃癌的生長(zhǎng)[3]，但也有研究表明BMP2可以促進(jìn)肺癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)和乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移[9-10]。另外，BMP通路在結(jié)直腸癌中處于失活的狀態(tài)，卻在癌前腺瘤中保持活躍[11]。雖然已有大量的研究探討了 BMP 家族成員在腫瘤形成中的作用，如 BMP2、BMP4和BMP7等[3-4]，但是BMP3在癌癥中作用的研究仍然很少。

表1 BMP3蛋白表達(dá)與肝門部膽管癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

Table 1.The relationship between the expression of BMP3 and clinicopathological factors in the patients with hilar cholangiocarcinoma

IndexnBMP3expressionNegative(n=87)Weakpositive(n=16)PAge(years)10354.33±11.9757.50±12.24>0.05Gender>0.05 Male635211 Female40355Sizeoftumor(cm)1032.41±0.732.45±0.84>0.05Bismuth-Corlettestage>0.05 Ⅰ+Ⅱ35287 Ⅲ+Ⅳ68599MSKCCstage>0.05 T1655114 T225241 T313121TNMstage<0.05 Ⅰ+Ⅱ655114 Ⅲ+Ⅳ38362Lymphaticmetastasis<0.05 Negative675314 Positive36342Differentiation<0.01 Well311813 Moderate-poor72693CA199(×103U/L)>0.05 <3534277 ≥3569609CA125(×103U/L)>0.05 <35594712 ≥3544404CEA(μg/L)>0.05 <561529 ≥542357

Thet-test was used for the measurement data; the Chi-square test or analysis of Fisher exact propability was conducted for the count data.

BMP3基因位于人類4號(hào)染色體長(zhǎng)臂上(4q21.21)，其編碼的BMP3具有472個(gè)氨基酸，是分泌型糖蛋白。近期的研究表明BMP3基因在結(jié)直腸癌和胃癌的發(fā)生發(fā)展中很有可能起著抑癌基因的作用[12-13]。BMP3基因在結(jié)直腸癌和胃癌中發(fā)生較高頻率的甲基化，而在正常的組織中則較低[13-14]，甲基化導(dǎo)致了BMP3基因在結(jié)腸癌和胃癌中沉默，但BMP3基因在肝門部膽管癌組織中的作用機(jī)制研究仍未見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示BMP3蛋白在肝門部膽管癌組織中表達(dá)降低，在癌旁組織中表達(dá)較高，且BMP3的mRNA水平與蛋白的表達(dá)水平一致，這提示BMP3在肝門部膽管癌組織轉(zhuǎn)錄前后表達(dá)量均有所下降，這表明BMP3基因在肝門部膽管癌組織中處于抑制狀態(tài)。進(jìn)一步分析BMP3蛋白的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)BMP3蛋白的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤的分化程度密切相關(guān)。TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期患者的BMP3蛋白的表達(dá)水平明顯低于Ⅰ期和Ⅱ期的患者，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中BMP3蛋白的表達(dá)明顯低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，腫瘤的分化程度越低，BMP3蛋白的表達(dá)量越低。這些均提示，BMP3基因表達(dá)的下調(diào)與肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，BMP3基因的下調(diào)與膽管癌的侵襲、轉(zhuǎn)移、腫瘤的惡性程度密切相關(guān)。但肝門部膽管癌中BMP3基因表達(dá)的下調(diào)是否與基因發(fā)生甲基化相關(guān)仍需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

本研究首次揭示了BMP3基因表達(dá)與肝門部膽管癌臨床病理的關(guān)系。本研究表明隨著腫瘤分期的加重和惡性程度的增加，BMP3蛋白的表達(dá)降低。這不僅說(shuō)明BMP3基因在肝門部膽管癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，更提示BMP3基因有可能成為一個(gè)新的診斷和潛在的治療靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究BMP3基因的作用機(jī)制將有利于肝門部膽管癌的靶向治療。

[1] Carreira AC, Alves GG, Zambuzzi WF, et al. Bone morphogenetic proteins: structure, biological function and therapeutic applications[J]. Arch Biochem Biophys, 2014, 561:64-73.

[2] Sartori R, Gregorevic P, Sandri M. TGFβ and BMP signaling in skeletal muscle: potential significance for muscle-related disease[J]. Trends Endocrinol Metab, 2014, 25(9):464-471.

[3] Shirai YT, Ehata S, Yashiro M, et al. Bone morphogenetic protein-2 and -4 play tumor suppressive roles in human diffuse-type gastric carcinoma[J]. Am J Pathol, 2011, 179(6):2920-2930.

[4] Kobayashi A, Okuda H, Xing F, et al. Bone morphogenetic protein 7 in dormancy and metastasis of prostate cancer stem-like cells in bone[J]. J Exp Med, 2011, 208(13): 2641-2655.

[5] 葉立偉，陳 嫻，武 睿，等. 人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和9對(duì)人胃癌MNK-45細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響及其機(jī)制[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2012, 28(12): 2160-2166.

[6] Zhimin G, Noor H, Jian-Bo Z, et al. Advances in diagnosis and treatment of hilar cholangiocarcinoma:a review[J]. Med Sci Monit, 2013, 19:648-656.

[7] Darwish MS, Kim WR, Harnois DM, et al. Efficacy of neoadjuvant chemoradiation, followed by liver transplantation, for perihilar cholangiocarcinoma at 12 US centers[J]. Gastroenterol, 2012, 143(1):88-98.e3.

[8] Khan SA, Davidson BR, Goldin RD, et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of cholangiocarcinoma: an update[J]. Gut, 2012, 61(12):1657-1669.

[9] Langenfeld EM, Kong Y, Langenfeld J. Bone morphogenetic protein 2 stimulation of tumor growth involves the activation of Smad-1/5[J]. Oncogene， 2006, 25(5):685-692.

[10]Katsuno Y, Hanyu A, Kanda H, et al. Bone morphogenetic protein signaling enhances invasion and bone metastasis of breast cancer cells through Smad pathway[J]. Oncogene, 2008, 27(49):6322-6333.

[11]Kodach LL, Bleuming SA, Musler AR, et al. The bone morphogenetic protein pathway is active in human colon adenomas and inactivated in colorectal cancer[J]. Cancer, 2008, 112(2):300-306.

[12]Zou H, Harrington JJ, Shire AM, et al. Highly methylated genes in colorectal neoplasia: implications for screening[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2007, 16(12):2686-2696.

[13]Loh K, Chia JA, Greco S, et al. Bone morphogenic protein 3 inactivation is an early and frequent event in colo-rectal cancer development[J]. Genes Chromosomes Can-cer, 2008, 47(6):449-460.

[14]Chen XR, Wang JW, Li X, et al. Role of BMP3 in progression of gastric carcinoma in Chinese people[J]. World J Gastroenterol, 2010, 16(11): 1409-1413.

Expression and clinical significance of bone morphogenetic protein 3 in hilar cholangiocarcinoma tissues

LI Xun, TANG Di, ZHOU Qi, WANG Huan-yu, CHEN Jian-cong, ZHU Xiao-xu, YIN Xiao-yu, LIANG Li-jian

(DepartmentofHepatobiliarySurgery,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:tangdi@126.com)

AIM: To investigate the expression and clinical significance of bone morphogenetic protein 3 (BMP3) in hilar cholangiocarcinoma tissues. METHODS: Thirty cases of hilar cholangiocarcinoma specimens were collected. The expression of BMP3 at mRNA and protein levels in the tumor tissues and paracancerous tissues was detected by real-time PCR and Western blot. The hilar cholangiocarcinoma paraffin-embedded specimens (n=103) were collected. The protein expression of BMP3 was determined by immunohistochemical method, and the relationship of BMP3 protein expression with clinical pathological characteristics was evaluated. RESULTS: In the 30 patients with hilar cholangiocarcinoma, the expressions of BMP3 protein and mRNA in 22 cases of tumor tissues were significantly decreased compared with the adjacent normal tissues. The results of immunohistochemistry showed that 87 cases were negative and 16 cases were weakly positive in all 103 cases of hilar cholangiocarcinoma. The expression of BMP3 protein was associated with the tumor TNM staging, lymph node metastasis and tumor differentiation (P<0.05). CONCLUSION:BMP3 gene might be inhibited in human hilar cholangiocarcinoma. The down-regulation ofBMP3 gene might be associated with the carcinogenesis and development of hilar cholangiocarcinoma.

Hilar cholangiocarcinoma; Bone morphogenetic protein 3

1000- 4718(2015)04- 0615- 05

2014- 11- 24

2015- 01- 23

廣東省科技計(jì)劃(No.2012B061700105);廣州市科技計(jì)劃(No.201300000187)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.04.007

△通訊作者 Tel: 020-87755766； E-mail：tangdi@126.com