羅格列酮對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1、VEGF-A及COX-2表達的影響*

陳爭躍， 余雄偉， 聶振禹 ， 趙 宇， 步世忠， 包蓓艷△

(1寧波大學 糖尿病研究中心，潤良糖尿病研究室，浙江 寧波 315211； 2寧波市泌尿腎病醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 寧波 315192)

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羅格列酮對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1、VEGF-A及COX-2表達的影響*

陳爭躍1， 余雄偉1， 聶振禹2， 趙 宇2， 步世忠1， 包蓓艷2△

(1寧波大學 糖尿病研究中心，潤良糖尿病研究室，浙江 寧波 315211；2寧波市泌尿腎病醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江 寧波 315192)

目的： 探討羅格列酮對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞水孔蛋白1 (AQP1)、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A) 及環(huán)氧合酶2 (COX-2)蛋白的影響。方法: (1) 體外培養(yǎng)人腹膜微血管內(nèi)皮細胞并分為4組；用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學變化；(2) Western blotting 檢測細胞AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白的表達；(3)real-time PCR檢測細胞AQP1、VEGF-A及COX-2 mRNA 的表達。結果: 羅格列酮可促進人腹膜微血管內(nèi)皮細胞增殖，上調(diào)AQP1蛋白及基因的表達(P<0.05)，下調(diào)VEGF-A和COX-2蛋白和mRNA的表達，過氧化物酶體增殖物激活受體γ (PPAR-γ)拮抗劑GW9662可部分抑制羅格列酮上調(diào)的AQP1表達(P<0.05)，但對VEGF-A及COX-2表達無明顯影響(P>0.05)。結論: 羅格列酮能夠上調(diào)腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1的表達，下調(diào)VEGF-A 及COX-2的表達，這可能與羅格列酮增加腹膜水轉運、減輕腹膜纖維化有關。

腹膜微血管內(nèi)皮細胞； 水孔蛋白1； 血管內(nèi)皮生長因子； 環(huán)氧合酶2； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ

腹膜透析是臨床上治療終末期腎衰竭的一種替代方法，而腹膜透析相關性腹膜纖維化是連續(xù)性非臥床腹透患者最嚴重的并發(fā)癥，也是影響腹透病人長期生存和預后的重要因素。腹膜透析相關性腹膜纖維化的發(fā)生是一個復雜的病理發(fā)展過程，機制不完全明了，慢性腹膜炎癥及高糖透析液對腹膜的損傷是目前已知的導致腹膜纖維化的2個重要原因，主要表現(xiàn)為腹膜對小分子溶質轉運增加，超濾減少，而腹膜恰恰主要通過小孔和水孔蛋白1(aquaporin-1，AQP1)達到清除水的目的。過氧化物酶體增殖物激活受體γ (peroxisome proliferator activated receptor γ，PPAR-γ)是近年來備受關注的核內(nèi)受體轉錄因子超家族成員之一，目前，PPAR-γ在抗器官纖維化方面的作用已成為新的研究熱點[1]，而胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥羅格列酮 (rosiglitazone，RSG)是PPAR-γ的特異性激活劑，其能抑制轉化生長因子β (transforming growth factor-β，TGF-β)、膠原蛋白和纖連蛋白的表達，該抑制作用能被PPAR-γ拮抗劑GW9662所抵抗。我們在前期的動物實驗研究中發(fā)現(xiàn)，RGZ可以上調(diào)尿毒癥腹膜透析大鼠腹透的超濾量，而這種上調(diào)作用可以部分被PPAR-γ拮抗劑GW9662所拮抗[2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 能直接作用于血管內(nèi)皮細胞促進血管內(nèi)皮細胞增殖，增加血管通透性，研究發(fā)現(xiàn)，RGZ可通過抑制腎臟VEGF表達，延緩糖尿病腎病的發(fā)生，然而RGZ對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞表達VEGF的影響未見報道。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)又稱前列腺素過氧化物合成酶，目前對COX-2的研究多集中于腫瘤，幾乎未見COX-2與腹膜血管組織的相關報道，COX-2能夠通過誘導以VEGF為代表的促血管生長因子的表達，抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡，促進腫瘤血管的增殖。為了探討上述因子在腹膜血管內(nèi)皮細胞中的表達及RGZ對其表達的影響，進一步研究腹膜纖維化的發(fā)生機制，我們就羅格列酮對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1、VEGF-A和COX-2表達的影響展開研究。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone)；無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%EDTA-胰蛋白酶和胎牛血清(Gibco)； CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；羅格列酮和GW9662原粉(Cayman)；兔抗人Ⅷ因子相關抗原抗體、兔抗人血小板內(nèi)皮細胞黏附分子(CD31)抗體、兔抗人結蛋白(desmin)抗體和兔抗人細胞角蛋白8抗體(北京博奧森公司)；HRP標記的驢抗兔Ⅱ抗、FITC標記的羊抗兔熒光Ⅱ抗和DAB顯色試劑盒(武漢博士德)；GoTaq 兩步法RT-qPCR系統(tǒng)、 GoScript 逆轉錄酶系統(tǒng)和GoTaq? qPCR Master Mix(Promega)；TRIzol 試劑(Ambion)；兔抗人AQP1抗體、兔抗人VEGF-A抗體和兔抗人COX-2抗體(Santa Cruz)；熒光標記的羊抗兔Ⅱ抗(LICOR)；BCA法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞)；原代人腹膜微血管內(nèi)皮細胞株HUM-CELL-0116 (PriCells)。

2 試驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將原代人腹膜微血管內(nèi)皮細胞株接種在1%明膠包被的25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24～36 h后第1次換液，以后每2～3 d換1次液。當細胞生長融合至80%～90%時，用0.25% EDTA-胰蛋白酶消化，以1∶3傳代培養(yǎng)，取第3、4代用于實驗。

2.2 細胞鑒定 細胞形態(tài)學觀察并用免疫細胞化學鑒定其中CD31、Ⅷ因子相關抗原、desmin和細胞角蛋白8的表達。

2.3 實驗分組 將細胞分成4組:正常(normal，N)組用含葡萄糖的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；羅格列酮(RGZ)組用含10 μmol/L RGZ的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；GW9662(GW)組用含20μmol/L PPAR-γ拮抗劑GW9662的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)；GW+RGZ組用含PPAR-γ拮抗劑GW9662的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基提前作用細胞1 h后，加入含10 μmol/L RGZ的無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

2.4 CCK-8比色法檢測RGZ對細胞增殖的影響 將細胞以5×107/L密度接種于96孔板，每孔加0.1 mL培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按照分組情況分別處理細胞24 h、48 h和72 h(設置8個復孔)。棄培養(yǎng)基，每孔加入90 μL無酚紅RPMI-1640培養(yǎng)基和10 μL CCK-8液體，置于培養(yǎng)箱中孵育2 h，采用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔450 nm處吸光度(A450)，進行統(tǒng)計學分析。

2.5 滲透壓的測量 4組細胞用無酚紅培養(yǎng)基同步培養(yǎng)24 h后，采用滲透壓檢測儀檢測各組培養(yǎng)液的滲透壓，4組滲透壓分別為301(N組)、310(RGZ組)、313(GW組)和315(GW+RGZ組) mOsm/kg。

2.6 Real-time PCR 檢測AQP1、VEGF-A和COX-2 mRNA表達 當細胞生長融合至90%～95%時，按上述分組要求同步培養(yǎng)細胞24 h，采用TRIzol一步法抽提細胞總RNA，用GoScript 逆轉錄酶系統(tǒng)試劑盒合成cDNA，產(chǎn)物用GoTaq兩步法RT-qPCR 系統(tǒng)試劑盒進行PCR擴增。

PCR反應條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)；采用2-ΔΔCt法分析real-time PCR結果數(shù)據(jù)。

2.7 Western blotting 檢測AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白表達 當細胞生長融合至90%～95%時，按上述分組要求同步培養(yǎng)細胞24 h，提取細胞總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，配置5%的濃縮膠和12%的分離膠，取50 μg變性蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，并用0.22 μm的硝酸纖維素濾膜進行蛋白質轉膜，考馬斯亮藍染膠、麗春紅S染液染膜以觀察蛋白質是否轉移完全。用含5%牛血清白蛋白的封閉液進行封閉，Ⅰ抗(1∶500) 4 ℃孵育過夜，隨后熒光標記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶10 000)室溫避光孵育1 h，Licor Odyssey紅色紅外成像系統(tǒng)掃描實驗結果，最后分析各目的蛋白條帶與β-actin蛋白條帶灰度值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 細胞鑒定結果

細胞形態(tài)學觀察：倒置相差顯微鏡下觀察到細胞呈多邊形、星形，呈鋪路石樣生長。免疫細胞化學鑒定：CD31和Ⅷ因子相關抗原表達陽性，細胞漿染色呈棕黃色，desmin和細胞角蛋白8表達陰性，證實是血管內(nèi)皮細胞，見圖1。

Figure 1.Human peritoneal microvascular endothelial cells were identified at 48 h by immunocytochemistry (×200). A: anti-factor VIII; B: anti-cytokeratin 8; C: anti-CD31; D: anti-desmin.

2 RGZ對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞增殖的影響

我們選擇5 μmol/L、10 μmol/L和20 μmol/L 3個不同的RGZ濃度，real-time PCR 檢測AQP1 mRNA表達，發(fā)現(xiàn)AQP1表達量在10 μmol/L顯著增加，與10 μmol/L相比，20 μmol/L增加幅度較小，故本實驗RGZ濃度定為10 μmol/L。我們的研究結果顯示：與對照組相比，RGZ在各時點均對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞具有明顯的促進增殖的作用(P<0.05)；同時發(fā)現(xiàn)，RGZ+GW組在實驗的48 h和72 h時點上，均有不同程度的促進增殖作用(P<0.05)，但該組細胞增殖較RZG組低，見圖2。

Figure 2.Effect of RGZ on the cell proliferation. Mean±SD. n=8. *P<0.05 vs N group.

3 Real-time PCR 檢測AQP1、VEGF-A和COX-2 mRNA表達結果

我們選擇1、12、24、48 h共4個時點，real-time PCR 檢測AQP1 mRNA表達，發(fā)現(xiàn)AQP1表達量在24 h顯著增加，故本實驗時間定為24 h。與對照組相比，RGZ可以上調(diào)人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1 mRNA的表達，而該上調(diào)作用能部分被GW9662所拮抗(P<0.05)；RGZ下調(diào)VEGF-A和COX-2 mRNA的表達(P<0.05)，但GW9662對VEGF-A及COX-2 mRNA表達無明顯影響(P>0.05)，見圖3。

Figure 3.Effect of RGZ on the mRNA expression of AQR1,VEGF-A and COX-2. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

4 Western blotting 檢測AQP1、VEGF-A和COX-2蛋白表達結果

用兔抗人AQP-1多克隆抗體進行蛋白印跡,可在28 kD處檢測到一條帶，證實人腹膜微血管內(nèi)皮細胞表達AQP1。對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1表達水平的半定量分析結果顯示：RGZ可以上調(diào)人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1蛋白的表達，而該上調(diào)作用能部分被GW9662所拮抗(P<0.05)，見圖4。相反的，RGZ下調(diào)該細胞VEGF-A及COX-2蛋白表達(P<0.05)，但GW9662對VEGF-A及COX-2蛋白表達無明顯影響(P>0.05)，見圖5。

討 論

一直以來，腎臟水轉運通道蛋白靶向蛋白質組學被用于確定腎臟水鈉重吸收的潛在調(diào)節(jié)位點。以往的一項動物實驗發(fā)現(xiàn)RGZ上調(diào)腎臟Na+-K+-ATP酶含量，而布美他尼能夠抑制Na+-K+-2Cl-協(xié)同轉運蛋白、Na+/H+交換體3和水通道蛋白2、3的活性，由此可以斷定RGZ誘導的鈉潴留致使腎小管轉運蛋白增加及腎小球濾過率下降[3]。目前有研究提出TZDs誘導一部分病人液體潴留、水腫，但對其誘導液體潴留的機制存在爭議。大部分研究表明，該效應是通過腎小管鈉和水的重吸收，但具體涉及的腎單位部分和鈉運載體的作用尚不明確。有研究提出血管通透性增加可能是PPARγ激動劑造成組織水腫的原因：一項臨床試驗發(fā)現(xiàn)TZDs治療50例2型糖尿病患者16周后，血紅蛋白和血細胞比容減少[4]，證實PPARγ激動劑可能會增加血管通透性。

Figure 4.Effect of RGZ on the protein expression of AQP1 in the cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

Figure 5.Effect of RGZ on the protein expression of VEGF-A and COX-2 in the cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs N group.

AQP1位于各組織的無孔毛細血管內(nèi)皮細胞基底膜，包括腹膜，并且AQP1能夠促進毛細血管內(nèi)皮細胞水份的滲透運輸。本研究中我們發(fā)現(xiàn)RGZ可以促進人腹膜微血管內(nèi)皮細胞增殖，而在RGZ+GW組人腹膜微血管內(nèi)皮細胞與正常對照組相比仍有一定程度的增殖，提示我們PPAR-γ拮抗劑GW9662可能部分抑制細胞增殖作用，RGZ還可能通過其它途徑促進人腹膜微血管內(nèi)皮細胞增殖。以往的研究發(fā)現(xiàn)RGZ對不同的細胞作用不同，例如RGZ可通過激活p38 絲裂原活化蛋白激酶通路引發(fā)人肝癌HepG2細胞周期阻滯；并能抑制干細胞因子誘導的人肥大細胞-1(HMC-1)細胞遷移和纖維連接蛋白誘導的HMC-1細胞黏附，而RGZ對HMC-1細胞的這種作用可以被GW9662所阻斷[5]。本研究還發(fā)現(xiàn)RGZ可以上調(diào)人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1 mRNA及蛋白的表達，而這種上調(diào)作用可以部分被PPAR-γ拮抗劑GW9662所拮抗。一項動物實驗表明，糖皮質激素也能夠上調(diào)腹膜微血管AQP1的表達，導致自由水運輸顯著增加，而RGZ對AQP1的這一作用機制尚不明確。Zhang等[6]通過研究非洲爪蟾蜍卵母細胞表達的野生型AQP1通道，首次提出蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)的激活顯著增加AQP1依賴的透水性，該AQP1新途徑獨立于環(huán)核苷酸途徑，并可能有助于PKC激活后調(diào)控AQP1改變，從而調(diào)控如內(nèi)皮滲透性，血管生成，尿液濃縮等過程。

已知PPAR-γ在血管內(nèi)皮細胞上高表達，激活的PPAR-γ可以抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和血管新生，最近的研究發(fā)現(xiàn)TGZ誘導OP9脂肪細胞VEGF的表達，而GW9662抑制TGZ誘導的VEGF表達[7]。在本研究中，我們得到同樣的結果：RGZ可抑制人腹膜微血管內(nèi)皮細胞VEGF-A和COX-2表達，real-time PCR分析結果表明，經(jīng)RGZ處理后的24h腹膜微血管內(nèi)皮細胞表達VEGF-A和COX-2 mRNA下降，提示RGZ抑制VEGF-A和COX-2的表達，有可能參與抑制腹膜微血管發(fā)育。而對于RGZ影響VEGF-A和COX-2表達可能涉及不同的機制或信號通路：最近的一項研究發(fā)現(xiàn)PPAR-γ活化后可能會使細胞變形及大分子漏出，致內(nèi)皮細胞屏障功能紊亂[8]。和AQP1相似，Scoditti等[9]對人內(nèi)皮細胞血管新生的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF可通過PKC依賴途徑不完全性誘導細胞cAMP應答元件結合蛋白介導的COX-2表達，而RGZ可通過調(diào)控VEGF的表達來部分干預COX-2的表達。另一研究發(fā)現(xiàn)15-甲基前列腺素F2和RGZ作用于人子宮內(nèi)膜細胞，激活的PPAR-γ與VEGF基因啟動子區(qū)域的應答元件即PPRE序列結合，能夠抑制VEGF基因表達和VEGF分泌[10]。另外，體外實驗發(fā)現(xiàn)RGZ減少VEGF分泌的同時，抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的增殖、遷移和血管新生，表明RGZ可能通過減少HUVECs分泌VEGF從而實現(xiàn)對HUVECs血管生成的抑制作用。

綜上所述，本研究通過體外實驗觀察了RGZ對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞AQP1、VEGF-A和COX-2表達的影響,發(fā)現(xiàn)RGZ可促進人腹膜微血管內(nèi)皮細胞增殖，上調(diào)AQP1的表達，下調(diào)VEGF-A及COX-2的表達，而PPAR-γ拮抗劑可部分抑制羅格列酮上調(diào)的AQP1表達改變，但對VEGF-A 及COX-2表達無明顯影響。RGZ對人腹膜微血管內(nèi)皮細胞的具體調(diào)控機制較為復雜，且RGZ是否通過AQP1、VEGF-A和COX-2影響腹膜功能還有待更進一步的研究證實，是否可以指導臨床實踐而應用于腹透超濾衰竭的患者更需進一步的臨床研究。

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Effect of rosiglitazone on expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells

CHEN Zheng-yue1, YU Xiong-wei1, NIE Zhen-yu2, ZHAO Yu2, BU Shi-zhong1, BAO Bei-yan2

(1DiabetesCenterofNingboUniversity,RunLiangDiabetesResearchLaboratory,NingboUniversity,Ningbo315211,China;2DepartmentofNeurology,NingboUrologyandNephrologyHospital,Ningbo315192,China.E-mail:baobeiyan2007@sina.com)

AIM: To investigate the effect of rosiglitazone on the expression of aquaporin-1 (AQP1), vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A) and cyclooxygenase-2 (COX-2) in human peritoneal microvascular endothelial cells.METHODS: Cultured peritoneal microvascular endothelial cells were divided into 4 groups. The morphological changes of the cells were observed under inverted microscope. The protein expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells was determined by Western blotting. The mRNA expression of AQP1, VEGF-A and COX-2 in the cells was measured by real-time PCR. RESULTS: Rosiglitazone stimulated the proliferation of the cells. Rosiglitazone up-regulated the expression of AQP1, and down-regulated the expression of VEGF-2 and COX-2 at mRNA and protein levels in the cells. The PPAR-γ antagonist GW9662 partly inhibited the up-regulation of AQP1 expression by rosiglitazone (P<0.05), but had no obvious effect on the expression of VEGF-A and COX-2 (P>0.05). CONCLUSION: Rosiglitazone up-regulates the expression of AQP1 and down-regulates the expression of VEGF-A and COX-2 in human peritoneal microvascular endothelial cells, thus promoting water transportation and attenuating peritoneal fibrosis during peritoneal dialysis.

Peritoneal microvascular endothelial cells; Aquaporin-1; Vascular endothelial growth factor; Cyclooxygenase-2; Peroxisome proliferator-activated receptor γ

1000- 4718(2015)01- 0044- 05

2014- 08- 06

2014- 10- 23

浙江省自然科學基金資助項目(No. Y13H050021)； 寧波市衛(wèi)生局項目(No.2010A18)

△通訊作者 Tel: 0574-83039290; E-mail: baobeiyan2007@sina.com

R363； R329.2+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2015.01.009