中藥材天南星根腐病病原菌的分離與鑒定

袁孟娟　張薇　董慧鈞　等

摘要：采用組織分離法、梯度稀釋法分離并純化出天南星根腐病的致病菌，并進(jìn)行病原菌致病性測(cè)定，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)鑒定，確定天南星根腐病的主要致病菌是毛霉屬的卷枝毛霉。

關(guān)鍵詞：天南星；根腐??；毛霉

中圖分類號(hào)： S435.67文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）01-0153-02

收稿日期：2014-02-25

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2013CQ019）；聊城大學(xué)博士科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：3010）。

作者簡(jiǎn)介：袁孟娟（1990—），女，山東日照人，碩士研究生，主要從事生物制藥研究。E-mail：yuanmengjuan1990@163.com。

通信作者：陳芳，博士，副教授，主要從事微生物制藥研究。E-mail：chenfang20045@163.com。天南星是一種重要的中藥材，具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫等功效，可用于治療頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅、口眼歪斜、半身不遂、癲癇、驚風(fēng)、破傷風(fēng)等癥[1]。天南星根腐病是一種土傳病害，傳染性極強(qiáng)，一株植株出現(xiàn)病癥，臨近的植株大多會(huì)被傳染，天南星根腐病病菌主要靠水傳播，波及范圍廣，如果不注意防治，將造成較大損失。植株感染天南星根腐病病菌后，首先出現(xiàn)褐色斑點(diǎn)，周圍有黃色暈圈，最后葉片枯萎，植株死亡。根腐病對(duì)天南星產(chǎn)量、品質(zhì)影響極大。本研究從山東省茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地采集天南星根腐病病株，用組織分離法對(duì)天南星根腐病原菌進(jìn)行了分離純化與鑒定，觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀、孢子形狀，結(jié)合致病性測(cè)定及菌株分子生物學(xué)鑒定方法確定病原菌的種屬分類[2]，并且在天南星根際土壤中分離得到大量具有拮抗活性的有益微生物，利用這些拮抗微生物對(duì)天南星土傳病害進(jìn)行生物防治，旨在為天南星根腐病的有效防治提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

天南星根腐病病株采自山東省茌平縣杜郎口鎮(zhèn)中藥材種植基地。

1.2病原菌分離方法

為降低腐生菌的干擾，以新鮮發(fā)病的植物組織作為分離材料，選取發(fā)病部位、健全部位之間（病健交界處）的組織進(jìn)行分離[3]。取天南星根腐病株的塊莖，掰開后用鑷子刮取斷面上的發(fā)病組織，均勻涂布在制好的培養(yǎng)基上。采用組織分離法分離病原菌，從病株刮取適量組織，用5%NaOCl溶液消毒3 min，無菌水洗2～3次，用滅菌濾紙吸干，分別接種到LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基上，于恒溫培養(yǎng)箱中25～28 ℃倒置培養(yǎng)5 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況[4]。

1.3病原菌純化方法

在無菌條件下，從菌落邊緣部分挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)2 d，待菌絲長(zhǎng)出后進(jìn)行多次重復(fù)培養(yǎng)，確定培養(yǎng)皿中無其他雜菌后進(jìn)行轉(zhuǎn)管，4 ℃冰箱保存。

1.4天南星根腐病病原菌Tnx的形態(tài)學(xué)鑒定

肉眼直接觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)、色澤等。選擇生長(zhǎng)狀況良好的菌落挑取菌絲、孢子制成臨時(shí)裝片，在顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)、有無孢子等。若有孢子則進(jìn)一步觀察孢子形狀及多少、有無隔膜及隔膜數(shù)、產(chǎn)孢細(xì)胞類型、厚垣孢子的有無、子實(shí)體類型等，并測(cè)量孢子大小，對(duì)Tnx菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學(xué)鑒定

用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取基因組DNA。采用引物 NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）、NS6（5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′）對(duì)供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL，5×buffer（含Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）1 μL，F(xiàn)（10 μmol/L）0.5 μL，R（10 μmol/L）0.5 μL，并加ddH2O至25 μL。PCR循環(huán)條件：預(yù)變性（98 ℃，3 min）→變性（98 ℃，25 s）→退火（55 ℃，25 s）→延伸（72 ℃，1 min）→修復(fù)延伸（72 ℃，10 min）→終止反應(yīng)（4 ℃，∞），30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)拍照記錄，得到目的條帶后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。用所獲菌株的rDNA-NS序列信息同GenBank中的序列信息進(jìn)行同源性比對(duì)，確定病原菌的種類。

1.6天南星根腐病病原菌Tnx的致病性鑒定

采用根部切傷接種法接種，將分離的病原菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，從培養(yǎng)基上刮取菌絲，制成孢子懸浮液，在顯微鏡下用孢子計(jì)數(shù)器將孢子懸浮液濃度調(diào)至106個(gè)/mL接種健康植株根部，接種量為10 mL/株，每處理重復(fù)3次，設(shè)清水作為對(duì)照，定期觀察并記錄發(fā)病情況。接種植株出現(xiàn)癥狀后，比較其癥狀是否與田間癥狀一致，再次進(jìn)行病原菌分離，比較分離前后得到的病原菌菌落形態(tài)、色澤、孢子等特征是否一致[5]。2結(jié)果與分析

2.1天南星根腐病病原菌Tnx的分離純化結(jié)果

分離純化得到的病原菌見圖1。

2.2天南星根腐病病原菌Tnx的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

天南星的根腐病原菌生長(zhǎng)速度比其他病原真菌快，一般接種后1～2 d即可觀察到白色菌落，呈圓形，孢子長(zhǎng)出后略呈黑色，孢子在顯微鏡下呈橢圓狀（圖2、圖3）。

2.3天南星根腐病病原菌Tnx的分子生物學(xué)鑒定

測(cè)序結(jié)果表明，天南星根腐病病原菌Tnx 18S rDNA為 1 354 bp，Blast比對(duì)結(jié)果表明，該序列與毛霉屬相似度達(dá)99%。

2.4天南星根腐病病原菌Tnx致病性鑒定

經(jīng)根部切傷接種法接種的天南星植株表現(xiàn)出根腐病的一系列癥狀，與田間癥狀一致。從病組織上再次進(jìn)行病原菌分離得到的病原菌與先前分離的病原菌菌落形態(tài)一致。對(duì)照組天南星植株不出現(xiàn)根腐病的癥狀，從其植株中分離不出根腐病病原菌（圖4、圖5）。

3結(jié)論

通過對(duì)天南星根腐病原菌病情調(diào)查，得知天南星根腐病是由真菌引起的一種土傳病害，近年來傳播蔓延較快，嚴(yán)重影響天南星的產(chǎn)量、質(zhì)量。本研究對(duì)天南星根腐病原菌的分離到了一種病原菌Tnx，經(jīng)過分子生物學(xué)18S rDNA鑒定，得知該病原菌為卷枝毛霉。

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