SELEX 技術(shù)的研究進(jìn)展及在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

樸喜航，任姝穎，夏 薇 (北華大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一種能獲取與靶分子高選擇、高親和力結(jié)合的寡核苷酸的篩選技術(shù)，制備出的產(chǎn)物被稱為適配體(aptamers)［1］。適配體安全、無毒，具備特殊的三維結(jié)構(gòu)，確保了其可與靶分子高特異性的結(jié)合，并可進(jìn)一步改變靶分子的生物活性和生命進(jìn)程。適配體最大優(yōu)勢是沒有免疫原性，并且分子量小、可化學(xué)合成、穩(wěn)定性強(qiáng)、易于修飾和標(biāo)記，與傳統(tǒng)化學(xué)方法和免疫學(xué)方法相比，具有無可比擬的優(yōu)越性。近年來在傳統(tǒng)SELEX 技術(shù)基礎(chǔ)上，各類衍生SELEX 技術(shù)也被不斷發(fā)展和完善，被廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)研究、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域，特別是在疾病的診斷與治療等方面，顯示出廣闊的應(yīng)用前景。目前已有幾種適配體診斷技術(shù)和適配體藥物進(jìn)入到了臨床試驗(yàn)或臨床應(yīng)用階段［2］。

1 SELEX 技術(shù)簡介

1.1 篩選過程

SELEX 技術(shù)依據(jù)分子生物學(xué)的原理，首先人工構(gòu)建一個隨機(jī)寡核苷酸文庫，隨機(jī)核苷酸序列的長度為20 ～40 bp 左右，庫容量為1014～1015個寡核苷酸，所包含的不同種立體構(gòu)象，幾乎可以涵蓋自然界存在的所有種類的靶分子［3］。將靶標(biāo)物質(zhì)與隨機(jī)文庫在一定條件下進(jìn)行混合，形成文庫-靶標(biāo)復(fù)合物，把未結(jié)合的核酸洗脫掉，富集與靶物質(zhì)結(jié)合的核酸分子，以后者為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物經(jīng)分離純化后，作為進(jìn)行下一輪篩選的模板。如此反復(fù)，通過多輪(8 ～15 輪)篩選，與靶標(biāo)不結(jié)合或親和性弱的核酸分子被充分去除，而與靶分子親和性強(qiáng)的核酸分子被分離出來［4］，同時其純度隨著篩選輪數(shù)的增加而增加。最后篩選到的文庫要經(jīng)過克隆測序和特異性修飾，經(jīng)過這些步驟后，所獲得的特異識別靶分子的核酸才是適配體［5］。

1.2 優(yōu)勢和特點(diǎn)

1)親和力高、特異性強(qiáng)。適配體與靶標(biāo)之間，憑借彼此互補(bǔ)的三維結(jié)構(gòu)，相互作用后形成牢固穩(wěn)定的復(fù)合物，其解離常數(shù)通常能達(dá)到pmol/L ～nmol/L 的水平，并且能分辨出靶標(biāo)結(jié)構(gòu)上細(xì)微的差別。

2)庫容量大，識別范圍廣泛。SELEX 技術(shù)的靶標(biāo)遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于經(jīng)典的抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，除了有蛋白質(zhì)、核苷酸分子外，還可以是糖類、氨基酸、維生素、抗生素、金屬離子、有機(jī)染料，甚至可以是細(xì)菌、病毒、寄生蟲等完整的細(xì)胞或組織，幾乎囊括了自然界中的全部物質(zhì)［6］。

3)合成容易，獲得方便，易于修飾。適配體的體積比傳統(tǒng)抗體小，篩選過程簡便、周期短，對實(shí)驗(yàn)室的要求不高，并具備自動化控制的巨大潛力。經(jīng)過化學(xué)合成和修飾以后可保持原生物活性不變，還可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性并增加其他新的化學(xué)性質(zhì)，參加多類反應(yīng)。標(biāo)記了熒光、生物素和納米金顆粒之后，發(fā)展出了諸如分子成像技術(shù)等疾病診斷新方法。

4)重復(fù)性好，純度高。整個篩選和制備的過程在人為控制之下，所得到的適配體幾乎沒有生產(chǎn)批次之間的差異，便于日后的大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。

5)分子量小、穩(wěn)定性高。相對于抗體或酶，適配體的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，不易降解，對溫度不敏感，保存時間長，即使變形也能在很短的時間內(nèi)復(fù)性，利于室溫下運(yùn)輸［7］。

6)應(yīng)用便捷。SELEX 技術(shù)所獲得的適配體又被稱作是核酸型抗體，其優(yōu)于傳統(tǒng)抗體的性質(zhì)是沒有免疫原性，因此便能獲得一些低免疫原性甚至無免疫原性靶分子的適配體。并且還省去了傳統(tǒng)抗體制備過程中的動物實(shí)驗(yàn)，而直接從體外文庫中獲取［8］。而且適配體更容易通過細(xì)胞膜，并且沒有毒性，利于檢測細(xì)胞內(nèi)的靶分子和實(shí)現(xiàn)多層次的調(diào)控，并能較快地被機(jī)體清除代謝掉，經(jīng)過特定的化學(xué)修飾后，還可使半衰期延長，穩(wěn)定性提高，便于科學(xué)研究和疾病診治。

2 SELEX 技術(shù)的發(fā)展

目前SELEX 技術(shù)出現(xiàn)了一些新的篩選方法，越來越多的與各種標(biāo)靶相對應(yīng)的適配體被篩選出來。如毛細(xì)管電泳法、硝酸纖維素膜過濾法、磁珠分離法、親和色譜法、Non-SELEX 技術(shù)、無引物PCR-SELEX技術(shù)、微流體SELEX 技術(shù)、生物芯片SELEX 技術(shù)、原子力顯微鏡等各種新的模式也被應(yīng)用到適配體的篩選中。同時還出現(xiàn)了SELEX 技術(shù)與定量PCR，SELEX 技術(shù)與流式細(xì)胞儀、SELEX 技術(shù)與ELISA 的聯(lián)合應(yīng)用，更是極大的提升了篩選的效率和準(zhǔn)確性。

2.1 消減SELEX 技術(shù)

消減SELEX 技術(shù)是一種經(jīng)過改良的SELEX 技術(shù)［9］。以完整細(xì)胞為靶標(biāo)的消減SELEX 技術(shù)，是在篩選過程中以完整的細(xì)胞作為靶標(biāo)，并消減掉能與已知或未知的共有靶標(biāo)結(jié)合的配體，經(jīng)過消減后的次級隨機(jī)文庫再投入到特異靶標(biāo)的篩選中。它的意義在于可以實(shí)現(xiàn)從兩組高度同源的完整細(xì)胞中，篩選出針對其中一種細(xì)胞的特異性適配體。這項(xiàng)技術(shù)可應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤細(xì)胞識別結(jié)構(gòu)［10］，還可進(jìn)一步作為“生物導(dǎo)彈”，獨(dú)立完成靶向治療或攜帶藥物，未來將會在腫瘤的治療中發(fā)揮巨大的功效。

2.2 自動化SELEX 技術(shù)

傳統(tǒng)的SELEX 技術(shù)過程需要完成一套重復(fù)繁瑣的操作，使得篩選相對耗時耗力。自動化SELEX 技術(shù)的建立可以簡化篩選過程，節(jié)約時間和物品的消耗，實(shí)現(xiàn)高通量和限定范圍，達(dá)到同時篩選多個靶分子的效果［11］。自動化SELEX 技術(shù)離不開現(xiàn)代分離儀器的配合，后者的發(fā)展推動了前者的進(jìn)步。2001年Cox 等使用Biomek 2000 自動化工作站成功篩選到了溶菌酶的特異性適配體，通過這種自動化篩選平臺，不到2 d 就完成了12 輪的篩選［12］。

2.3 導(dǎo)向SELEX 技術(shù)

適配體的特異性是整個SELEX 技術(shù)的核心所在，為了提高適配體的特異性和穩(wěn)定性，可將已知的能與靶標(biāo)非特異結(jié)合的分子摻入到文庫中或預(yù)先與靶標(biāo)進(jìn)行混合后再篩選，這樣可獲得只與靶標(biāo)特異結(jié)合的適配體。2002 年Hamm 等將此技術(shù)與抗個體基因型的方法聯(lián)合運(yùn)用，成功獲得了特定激酶抑制劑的特異性RNA 適配體［13］。Martell 運(yùn)用特殊的導(dǎo)向SELEX 技術(shù)，從隨機(jī)表達(dá)盒雜交文庫中篩選到了能與E2F 蛋白具有高親和性的RNA 適配體［14］。

3 SELEX 技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

3.1 SELEX 技術(shù)在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

依據(jù)核酸適配體具有與靶物質(zhì)高特異性結(jié)合的能力，可以幫助我們尋找到疾病的發(fā)病機(jī)制。Roulet等提出把SELEX 技術(shù)同基因表達(dá)串行分析手段聯(lián)合應(yīng)用，并通過自動化的序列提取工藝，建立轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的定位模型。通過對轉(zhuǎn)錄因子適配體文庫中的某一序列進(jìn)行測序，可了解該蛋白結(jié)合位點(diǎn)的特異性，探尋一些以前在基因組中從未研究過的結(jié)合位點(diǎn)，掌握在不同的核苷酸位點(diǎn)上非獨(dú)立堿基出現(xiàn)的先后順序，為闡明其結(jié)合機(jī)制提供一些線索［15］。Bianchi 等采取SELEX 技術(shù)發(fā)現(xiàn)，TRF1 二聚體在端粒上有兩個相同的識別半位點(diǎn)，它們的距離可以變化，且兩個半位點(diǎn)的順序方向沒有區(qū)別。這為探索端粒長度的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了新依據(jù)［16］。

3.2 SELEX 技術(shù)在疾病診斷中的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞及其標(biāo)志物的早期檢測對于腫瘤的診斷及預(yù)后極為重要，目前已經(jīng)篩選出多種腫瘤的特異性適配體，例如急性髓系白血病的適配體KH1C12、急性淋巴細(xì)胞白血病的適配體sgc8/sgc3/sgd3、惡性膠質(zhì)瘤的適配體GBI-10、Burrkitt 淋巴瘤的適配體TD05、非小細(xì)胞肺癌的適配體S1/S11e/S15、小細(xì)胞肺癌的適配體HCA12/HCC03/HCH07/HCH01、乳腺癌的適配體KMF2-1a、結(jié)腸癌的適配體KDED2/KDED7/KDED9/KC2D3、小鼠肝癌的適配體TLS9a/TLS11a、卵巢癌的適配體DOV3/DOV4/DOV6。它們可以特異地識別腫瘤細(xì)胞，僅需少量腫瘤細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的鑒別和分型。將適配體與納米顆粒結(jié)合后通過比色檢測，觀察顏色的變化即可判斷有無靶標(biāo)細(xì)胞。這個實(shí)驗(yàn)非常敏感，樣本中的靶細(xì)胞數(shù)超過百個即可檢測出來［17］，還不需要昂貴的檢測設(shè)備和待檢靶標(biāo)的標(biāo)記與修飾。因此，有可能成為常規(guī)篩查活體標(biāo)本中新生腫瘤細(xì)胞的一種新方案。與此同時腫瘤細(xì)胞的分子成像技術(shù)也已經(jīng)問世，它能夠從細(xì)胞水平對生物過程進(jìn)行可視化描述及測量，不僅能定位病灶，觀察某些影響腫瘤細(xì)胞行為的生物過程，還能觀察腫瘤細(xì)胞對藥物的反應(yīng)［18］。Kim 等研究將前列腺特異性膜抗原(PSMA)的特異性適配體與金納米材料結(jié)合后，帶有PSMA 的前列腺癌細(xì)胞便能夠被特異性地標(biāo)記出來，將其作為造影劑應(yīng)用在前列腺腫瘤的影像學(xué)診斷中，比傳統(tǒng)的造影劑顯像時間更持久，毒副作用更小，應(yīng)用價值更顯著［19］。

SELEX 技術(shù)還在血液的生化檢查方面，顯示出一定的應(yīng)用前景。用其檢測血液中的某些靶分子，將比傳統(tǒng)方法更特異和高效。腦尿鈉肽(BNP)常被臨床上用來評價急性心力衰竭或急性呼吸窘迫癥患者的病情和預(yù)后。Lin 等采用SELEX 技術(shù)的原理，篩選到了能與BNP 特異結(jié)合的適配體。在微流體試驗(yàn)?zāi)Ｊ较?，被熒光?biāo)記的適配體可以快速測出血液中BNP 的濃度，比放射免疫分析法或是免疫分析技術(shù)更精確、更經(jīng)濟(jì)［20］。C 反應(yīng)蛋白(CRP)是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下生成的一種非特異性的急性時相反應(yīng)蛋白，CRP 與冠狀動脈粥樣硬化、心肌梗死等心血管疾病具相關(guān)性［21］。Bini 等開發(fā)出了一種帶有光化學(xué)性質(zhì)的CRP 特異性適配體，當(dāng)血液中的CRP 濃度超0.005 mg/L 時就能被檢測出來，敏感度非常高。這一成果為新型CRP 診斷試劑的研制奠定了基礎(chǔ)［22］。

SELEX 技術(shù)還被應(yīng)用在病原微生物的檢測，其能克服傳統(tǒng)檢測方法在特異性和敏感性上的缺陷，為新型檢測試劑盒的開發(fā)提供有力支持。例如結(jié)合分支桿菌的特異性適配體CSRI 2.11 檢測過程比傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法更省時更敏感;丙型肝炎病毒的適配體ZE2 可結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)丙型肝炎的早期篩查，不受抗體檢測時窗口期的制約;瘧原蟲乳酸脫氫酶的適配體PL1 在臨床實(shí)踐中，可以很好的區(qū)分患者是否感染了出間日瘧原蟲或惡性瘧原蟲［23］。

3.3 SELEX 技術(shù)在疾病治療中的應(yīng)用

SELEX 技術(shù)在疾病治療中的功效越來越來受到人們的重視。適配體在體內(nèi)與靶分子結(jié)合，理論上可以對靶分子的生理功能和代謝過程產(chǎn)生影響，靶分子也會因此發(fā)生信號傳導(dǎo)的改變甚至喪失原本的功能，直接或間接阻斷疾病發(fā)生進(jìn)程［24］。以此開發(fā)的靶蛋白功能阻斷劑，日益顯示出其巨大的潛力。全球首個適配體藥物是2004 年由美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)上市的哌加他尼鈉，可用來治療老年性黃斑變性。

SELEX 技術(shù)在凝血系統(tǒng)疾病的治療上具有一定的意義，已找到了可用作抗凝血和抗血栓藥物的適配體REG-1，其結(jié)合的位點(diǎn)是凝血酶的肝素結(jié)合位點(diǎn)以及纖維蛋白原結(jié)合位點(diǎn)［25］。在治療免疫系統(tǒng)疾病方面，也已獲得了具有藥物開發(fā)潛力的特異性適配體［26］，如可用來拮抗自身抗體已達(dá)到治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的適配體，還有能刺激T 細(xì)胞釋放的4-1BB 的適配體。對于腫瘤的治療，基于SELEX 技術(shù)研制的適配體藥物更是走在前列，進(jìn)入到了臨床試驗(yàn)階段。如對實(shí)體瘤和復(fù)發(fā)性急性髓樣白血病有良好療效的AS1411，更出現(xiàn)了連接金納米棒的適配體，用作腫瘤靶向光熱治療［27］。適配體藥物作為抗病毒藥，也展現(xiàn)出良好的前景，比如用來抑制狂犬病病毒的復(fù)制和干擾艾滋病病毒的體內(nèi)合成［28］。除此以外，核酸適配體還可作為運(yùn)輸工具，特異性地把藥物運(yùn)送至靶標(biāo)細(xì)胞或組織達(dá)到定點(diǎn)清除的治療效果，研究比較成熟的有裝載著阿霉素，用來殺傷前列腺癌細(xì)胞的復(fù)合適配體藥物［29］。

4 展 望

目前，越來越多可用于疾病診斷和治療的適配體被逐步篩選出來，并被廣泛地應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)的各個領(lǐng)域。然而其在臨床中的大規(guī)模應(yīng)用仍為時尚早。還有許多問題亟須解決，例如具備高特異性、高親和力的適配體數(shù)目還相對較少;實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中篩選出的適配體，在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下發(fā)揮作用的實(shí)際效果尚不完全掌握;篩選過程還需進(jìn)一步簡化，產(chǎn)物的特異性和穩(wěn)定性還應(yīng)進(jìn)一步提高，以及對適配體的修飾和優(yōu)化方案還需進(jìn)一步明確。相信隨著現(xiàn)代技術(shù)的進(jìn)步，上述各種問題終將攻克，SELEX 技術(shù)在生命科學(xué)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用前景將會更加廣闊。

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