華蟾素治療原發(fā)性肝癌的多種作用機(jī)制

王寧寧，姚海燕，楊 陽(yáng)，張玉影，雒靜靜 綜述，齊 玲 審校 (吉林醫(yī)藥學(xué)院:.0 級(jí)檢驗(yàn)本科班，.0 級(jí)臨床本科班，.0 級(jí)預(yù)防本科班，4.病理教研室，吉林 吉林 0)

中華大蟾蜍是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材，將其陰干皮經(jīng)提取加工制成的滅菌水溶液即為華蟾素。華蟾素的主要生物活性成分為蟾毒內(nèi)酸類，如蟾酥毒素、脂蟾蜍配基、華蟾素毒基等［1］。華蟾素因其具有低毒、高效，并且對(duì)多種腫瘤都具有良好的治療效果而受到國(guó)內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。肝癌絕大多數(shù)為原發(fā)性肝癌，原發(fā)性肝癌是指原發(fā)于肝細(xì)胞的惡性腫瘤，它是人體最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率逐年上升。因此，深入研究華蟾素對(duì)肝癌的作用機(jī)制對(duì)肝癌的治療有著重大的意義［2］。

1 通過調(diào)控bcl-2/bax 影響肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞主動(dòng)性死亡模式，在腫瘤的形成和演變過程中起著重要的作用。現(xiàn)已知多種基因與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，包括bcl-2 家族基因、p53、FAS、FASL 等都參與了凋亡的調(diào)控［3］。bcl-2 家族蛋白是編碼能抑制或激活凋亡的膜結(jié)合蛋白。其中以bcl-2 蛋白最為主要，bcl-2 蛋白是一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的蛋白質(zhì)，主要分布在線粒體外膜、細(xì)胞核及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上［4］。在腫瘤發(fā)生過程中，bcl-2 是非常重要的一種促癌基因，它與bax 結(jié)合，形成二聚體，使bax 不能形成bax-bax 二聚體，從而阻止bax 啟動(dòng)凋亡程序，抑制細(xì)胞凋亡［5］。

研究證實(shí):當(dāng)bcl-2 高表達(dá)時(shí)，它能抑制諸多基因誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而通過bax 表達(dá)抑制bcl-2 的活性就可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡［6］。將不同濃度的華蟾素作用于肝癌細(xì)胞，Western blot 結(jié)果顯示:不同濃度的華蟾素有抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且這種作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴性［7］。如果在實(shí)驗(yàn)過程中，將不同濃度的華蟾素注射液作用于肝癌細(xì)胞后，可對(duì)bcl-2/bax 有不同程度的影響。由此可以推測(cè)，華蟾素通過改變肝癌細(xì)胞中bcl-2/bax 比例，從而影響肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使腫瘤凋亡程序得以啟動(dòng)，起到殺死腫瘤細(xì)胞的治療目的。

2 影響Fas/FasL 表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)

Fas 基因是細(xì)胞表面重要的死亡受體之一，也是細(xì)胞凋亡重要的信號(hào)分子，它屬于腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR)/神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(nervegrowthfactorreceptor，NGFR)家族的Ⅰ型跨膜糖蛋白。FasL 是Fas 在人體內(nèi)的天然配體，是屬于TNF 家族的Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達(dá)于激活的T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞部分腫瘤細(xì)胞表面等。Fas 與其配體FasL 結(jié)合活化并傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要途徑。通過Fas/FasL 使腫瘤細(xì)胞抵抗Fas 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要機(jī)制之一。

Stand 等［8］發(fā)現(xiàn):在正常肝臟和慢性肝病組織中，F(xiàn)as 表達(dá)明顯高于肝癌組織。Nagao 等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌患者的肝癌組織中Fas 表達(dá)下調(diào)，而非肝癌組織Fas 表達(dá)上調(diào);Fas 陽(yáng)性的肝癌患者肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶少，腫瘤細(xì)胞凋亡率高，患者存活時(shí)間長(zhǎng)。因此，肝癌細(xì)胞可能通過下調(diào)Fas 表達(dá)來逃避機(jī)體免疫監(jiān)視。Shin 等［10］發(fā)現(xiàn)，HBX 抗原能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞表達(dá)FasL，高表達(dá)FasL 的肝癌細(xì)胞與激活的T 細(xì)胞共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡、抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)、引起腫瘤增殖。所以，F(xiàn)as 的高表達(dá)可促使腫瘤細(xì)胞的凋亡，而FasL 的高度表達(dá)可誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡，引起腫瘤增殖。由此可知，華蟾素可以通過調(diào)控Fas/FasL 來影響腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。

3 通過影響CyclinA/CDK2 表達(dá)改變肝癌細(xì)胞周期

CyclinA 是人類cyclins 家族中重要成員之一，在細(xì)胞周期中起正相調(diào)節(jié)作用。它可以整合于HBV 的DNA 部位上，是導(dǎo)致肝癌的主要原因。CyclinA 存在于細(xì)胞核內(nèi)，在DNA 合成的G1 晚期出現(xiàn)，其作為調(diào)節(jié)亞基與相應(yīng)的細(xì)胞周期素依賴性激酶(cyclins dependent kinases，CDK)中的CDK2、CDC2(cell division cycle 2)特異性結(jié)合，參與細(xì)胞DNA 的復(fù)制及合成，并促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行分裂。CyclinA/CDK2/CDC2 復(fù)合物可使細(xì)胞順利完成并通過S 期、G2/M 期，如果該復(fù)合物表達(dá)出現(xiàn)異常，則可使具有缺陷的DNA 喪失修復(fù)的時(shí)間而直接進(jìn)入細(xì)胞周期，致使其出現(xiàn)異常增殖即生成腫瘤［11-14］。孫宇和陳華等［15-16］發(fā)現(xiàn)，華蟾素作用于HepG-2 細(xì)胞后部分體積變小，染色質(zhì)濃縮邊集，并將HepG-2 細(xì)胞阻滯于S 期。Dobashi Y 等在對(duì)非小細(xì)胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)CyclinA、CDK2 表達(dá)與S期細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)，與患者的生存期呈負(fù)相關(guān)［17］。因此，華蟾素可能通過CyclinA、CDK2 的表達(dá)變化使腫瘤細(xì)胞阻滯于S 期，進(jìn)而起到治療腫瘤的作用。

4 影響肝癌細(xì)胞DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶

DNA 增殖是細(xì)胞分裂的基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的主要特征之一就是失控的自主增殖，且染色體的數(shù)量大多為二倍體。因此，腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)、分裂的過程中，常伴隨著DNA 含量增加。華蟾素可直接破壞DNA 結(jié)構(gòu)、干擾其合成，達(dá)到阻斷細(xì)胞增殖的目的。Topo 酶是真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中的基本酶，廣泛存在于細(xì)胞核內(nèi)，是一種通過調(diào)節(jié)核酸空間動(dòng)態(tài)變化從而控制核酸生理功能的關(guān)鍵酶。該酶分為TopoⅠ和TopoⅡ兩種類型。TopoⅠ廣泛存在于原核和真核生物［18］能引起DNA 單鏈斷裂，在DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中起重要作用。TopoⅡ是真核生物所必需，在DNA 復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及在形成正確的染色體結(jié)構(gòu)、染色體分離、濃縮中發(fā)揮重要作用［19］，Topo 酶參與DNA 的復(fù)制、重組及復(fù)制等關(guān)鍵的核內(nèi)過程，是目前一線抗腫瘤藥物的主要作用靶點(diǎn)。因此，研究華蟾素作用于DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的機(jī)制有重要的意義。

陳華等［15］觀察華蟾素對(duì)HepG-2 細(xì)胞Topo ⅠmRNA 表達(dá)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，華蟾素可使TopoⅠmRNA表達(dá)顯著下調(diào)。這說明華蟾素對(duì)肝癌HepG-2 細(xì)胞TopoⅠ有抑制作用。田莉莉等［20］也證明，華蟾素可明顯下調(diào)TopoⅡmRNA 及蛋白的表達(dá)，呈劑量依賴性。高山［21］等也認(rèn)為，華蟾素下調(diào)TopoⅠ、TopoⅡ表達(dá)呈劑量依賴性。因此，有必要深入研究華蟾素如何影響Topo 酶，進(jìn)而干擾腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)作用。

5 展 望

綜上所述，華蟾素治療肝癌可能是通過多途徑起作用的，這一藥物有很好的療效及良好的應(yīng)用前景。但是目前，我們的首要任務(wù)還要進(jìn)一步探索華蟾素殺傷肝癌細(xì)胞的機(jī)制，以及與其他常用化療藥物等是否可以聯(lián)合用藥，是否可以與物理療法等有機(jī)的結(jié)合起來，是否還可以提取更有效的成分來治療肝癌。

［1］ 蘇永華，黃雪強(qiáng)，張大志，等.華蟾素注射液中蟾毒內(nèi)酯類成分含量檢測(cè)［J］.中成藥，2003，25(1):24-27.

［2］ 張振玉，張昆，王崇文，等.華蟾素對(duì)三種消化系腫瘤細(xì)胞殺傷機(jī)制研究［J］.中藥藥理與臨床，1999，15(5):28-29.

［3］ Yip KW，Reed JC.Bcl-2 family proteins and cancer［J］.Oncogene，2008，27(50):6398-6406.

［4］ 項(xiàng)永生，徐昆.凋亡與腦缺血損傷［J］.暨南大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版，2000，21(2):126-130.

［5］ 周永列，胡惟孝，呂亞萍，等.四嗪二甲酰胺對(duì)肺癌細(xì)胞株A549 的體內(nèi)外作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42(1):26-34.

［6］ 王海燕，蔡兵，崔承彬，等.蔓荊子活性成分vitexicarpin誘導(dǎo)K562 細(xì)胞凋亡的機(jī)制［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(1):27-31.

［7］ 齊芳華，李安源，趙林，等.華蟾素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2 凋亡及其作用機(jī)制［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45(3):318-323.

［8］ Stand S，Hofmann WJ，Hug H，et al.Lymphocyte apoptosis induced by CD95 (Apo-1/Fas)Ligand-expression tumor cells，a mechanism of immune evasion?［J］.Nat Med，1996，2(12):1361-1366.

［9］ Nagao M，Nakajima Y，Hisanaga M，et al.The alteration of Fas receptor and ligand system in hepatocellular carcinomas:how do hepatoma cells escape from the host immune surveillance in vivo［J］.Hepatology，1999，30(2):413-421.

［10］ Shin EC，Shin JS，Park JH，et al.Expression of fas Ligand in human hepatoma cell lines:role of hepatitis-B virus X(HBX)in induction of Fas ligand［J］.Int J Cancer，1999，82(4):587-591.

［11］ Fisher RP.Cdks and cyclins in transition［J］.Curr Opin Gene Dev，1997，7(1):32-38.

［12］ King KL，Cidlowski JA.Cell cycle regulation and apoptosis［J］.Annu Rev Physiol，1998，60(6):601.

［13］ Meikrantz W，Gisselbrecht S，Tam SW，et al.Activation of cyclinA-dependent protein kinases during apoptosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1994，9(19):3754.

［14］ Hoang AT，CohenK，Barrett JF，et al.Participation of cyclinA in Myc-induced apoptosis［J］.Proc Nat Acad Sci U S A，1994，91(15):6875.

［15］ 陳華，孫宇，崔曉楠.華蟾素注射液對(duì)人肝癌HEPG-2細(xì)胞DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的影響［J］.中國(guó)癌癥雜志，2010，20(3):197-201.

［16］ 孫宇，單路娟，劉越堅(jiān)，等.華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2 細(xì)胞增殖及凋亡的影響［J］.中國(guó)腫瘤，2010，19(6):410-413.

［17］ Dobashi Y.Jiang Shixu，Shoji M，el al.Diversity in expression and prognostic significance of G1/S cyclins in human primary lung carcinomas［J］.J Pathol，2003，199(2):208-220.

［18］ Liu LF.DNA topoisomerase poisons as antitumor drugs［J］.Annu Rev Biochem，1989，58:351-375.

［19］ Wang JC.DNA topoisomerases［J］.Annu Rev Biochem，1985，54(1):665.

［20］ 田莉莉，高山，崔曉楠.華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖與凋亡及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的影響［J］.中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2013，29(7):530-533.

［21］ 田莉莉，侯力，高山，等.華蟾素注射液對(duì)人肝癌HepG-2 細(xì)胞增殖及P-YAP 蛋白表達(dá)的影響［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20(1):153-156.