脂肪酸代謝預(yù)處理及其檢測方法的研究進(jìn)展

李美艷，趙慶豪，劉麗清 綜述，王愛武△ 審校

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250021)

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·綜 述·

脂肪酸代謝預(yù)處理及其檢測方法的研究進(jìn)展

李美艷1,2，趙慶豪3，劉麗清1綜述，王愛武1,2△審校

(1.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，濟(jì)南 250021;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355；3.山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250021)

脂肪酸代謝； 前處理方法； 甲酯化方法； 色譜分析

脂肪酸是指一端含有一個(gè)羧基的長的脂肪族碳?xì)滏湥菣C(jī)體主要能量來源之一。脂肪酸根據(jù)碳鏈的長短可分為短鏈、中鏈、長鏈脂肪酸；根據(jù)飽和度的不同可分為飽和、單不飽和、多不飽和脂肪酸。人和動(dòng)物體內(nèi)脂肪酸主要是長鏈脂肪酸，其來源一是機(jī)體自身合成，二是食物供給。脂肪酸在生命過程中具有非常重要的作用。研究表明，諸如高血壓、血脂紊亂、肥胖、胰島素抵抗、心腦血管疾病及腫瘤等多種疾病都與脂肪酸代謝異常有關(guān)[1-4]，因而脂肪酸代謝的研究越來越受到重視。本文對脂肪酸代謝檢測常用的前處理方法、甲酯化方法及色譜分析條件等綜述如下。

1 脂肪酸代謝檢測的前處理方法

1.1 動(dòng)物組織脂肪酸檢測的前處理 組織脂質(zhì)的提取方法多采用經(jīng)典的Folch法,具體方法是首先稱取一定量的組織，加入一定的氯仿/甲醇混合溶媒進(jìn)行勻漿，再加入蒸餾水離心處理[5]。也有研究者先用生理鹽水進(jìn)行勻漿，再用氯仿/甲醇進(jìn)行脂質(zhì)提取。禹曉等[6]研究α-亞麻酸對高脂模型大鼠組織脂肪酸代謝的影響。稱取0.10 g組織(肝臟、腦、腎及心)，放入玻璃手動(dòng)均質(zhì)器中，加入5 mL氯仿/甲醇(2∶1)，緩慢均質(zhì)1 min，過濾定容至5 mL。再加1 mL蒸餾水混勻，3 000 r/min離心15 min，除去溶劑上相，再用氯仿/甲醇/水(3∶48∶47)沖洗溶劑界面3次，下相及部分沖洗液加入甲醇后融為一相，氮?dú)?N2)吹干，-20 ℃保存至分析。 張侃等[7]對大鼠腦組織中必需脂肪酸進(jìn)行研究。稱取腦組織5 g，加入3 mL氯仿/甲醇(1∶2)，攪拌2 min，加氯仿5 mL攪拌30 s。再加蒸餾水5 mL攪拌30 s，抽濾，用少量氯仿洗滌殘?jiān)?。所得濾液靜止分層，分離，得油層待酯化分析用。李霖[8]選用-80 ℃保存下的80～120 mg大鼠肝臟組織放入勻漿器中，加1 mL生理鹽水研磨成勻漿，分兩次加氯仿2 mL，甲醇1 mL，合并2次提取液，下相用N2吹干后置-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 血清脂肪酸檢測的前處理 血清中的游離脂肪酸能初步反映機(jī)體代謝是否紊亂，且由于血清標(biāo)本制作過程簡單，關(guān)于血清脂肪酸的研究也較多。崔瑞芳[9]將收集到的-80 ℃保存的血液標(biāo)本于室溫下靜置1 h凝固后，在4 ℃下3 500 r/min離心15 min，分離血清，每份標(biāo)本200 μL，分裝后凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。宋虎等[10]將血清標(biāo)本100 μL加入300 μL氯仿/甲醇(1∶3)，渦旋振蕩30 s，混合液于-20 ℃沉淀10 min，4 ℃ 16 000 r/min離心10 min后，取上清液200 μL待衍生化用。

1.3 血漿脂肪酸檢測的前處理 血漿中游離脂肪酸的種類和濃度可以反映某些疾病與脂肪酸的關(guān)系，為進(jìn)一步研究脂肪酸代謝做好基礎(chǔ)。譚斌斌[11]提取人體血漿中脂肪酸時(shí)，將收集到的血液標(biāo)本立即以3 000 r/min離心10 min，分離所得血漿置-80 ℃保存待衍生化用。

1.4 紅細(xì)胞膜脂肪酸檢測的前處理 紅細(xì)胞膜是包裹在紅細(xì)胞外，具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的天然生物膜，雖然其本身并不具有脂質(zhì)合成的能力，但其脂質(zhì)代謝受紅細(xì)胞生理狀態(tài)的影響。楊芳等[12]吸取血液500 μL，按1∶30比例加入10 mmol/L pH=7.4的低滲三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液于15 mL試管中，輕搖混勻后放置4 ℃冰箱中溶血后，于4 ℃，9 000 r/min離心30 min，棄上層血清，再重復(fù)洗滌離心3次，得乳白色紅細(xì)胞膜。取100 μL 乳白色紅細(xì)胞膜于1 mL磷酸鹽緩沖液中，加入內(nèi)標(biāo)十九碳烷酸500 μL( 0.1 mg/mL，再加入2 mL氯仿/甲醇混合液(2∶1)，劇烈震蕩1 min，3 000 r/min離心5 min，吸取全部氯仿層，移至玻璃試管，N2吹干備用。

1.5 尿液脂肪酸檢測的前處理 檢測尿液中脂肪酸組成具有無創(chuàng)傷性、方便等優(yōu)點(diǎn)，尿液常常用于體內(nèi)脂肪酸的檢測。元冬娟等[13]取15 mL健康人晨尿于3 000 r/min離心10 min后取上清液5 mL，加15 mL氯仿/甲醇(2∶1)溶液，渦旋2 min，在室溫靜置60 min后取下層至密閉管，N2吹干備用。

2 甲酯化方法

脂肪酸的甲酯化方法主要包括酸處理法、堿處理法、三氟化硼方法等。不同的甲酯化方法適用對象有所不同，所用試劑的濃度、甲酯化溫度和時(shí)間等條件都會(huì)影響到脂肪酸的檢測。

2.1 酸處理法 酸催化法一般采用硫酸-甲醇(H2SO4/MeOH)溶液進(jìn)行甲酯化。李海靜等[14]取正常人血清200 μL，加入2.5% H2SO4/MeOH溶液1 mL，在60 ℃條件下水浴90 min，加1.5 mL生理鹽水溶液和1 mL正己烷，振蕩混勻，3 000 r/min離心5 min，取上層正己烷層N2吹干，正己烷復(fù)溶進(jìn)樣。韓莉妲[15]將分別含有酯化脂肪酸和非酯化脂肪酸的提取液吹干后，立即加入衍生化試劑5%H2SO4/MeOH溶液500 μL，密封反應(yīng)體系中加熱至70 ℃，反應(yīng)30 min。待反應(yīng)完畢后，放冷至室溫，加入200 μL的水。以正己烷500 μL萃取衍生化產(chǎn)物脂肪酸甲酯，上清液移至進(jìn)樣瓶中，定容為500 μL，待進(jìn)樣分析用。徐小作等[16]取血清0.5 mL，加入10% H2SO4/MeOH 1 mL，渦旋振蕩混勻，置60 ℃水浴1 h，取出冷至室溫，加入正己烷和飽和氯化鈉溶液各2 mL，渦旋混勻3 min，靜止30 min，3 000 r/ min離心10 min，取上層正己烷1.0 mL，N2吹干，待進(jìn)樣分析用。

2.2 堿處理法 堿衍生方法一般常用的為氫氧化鉀-甲醇(KOH-MeOH)衍生法。孫蓮等[17]將蕪菁子油32 mg置于10 mL量瓶中，加丙酮定容，精密吸取100 μL至刻度試管，N2吹干。加0.4 mL，0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇(KOH-CH3OH)溶液，60 ℃恒溫水浴皂化30 min，待油珠完全溶解，N2吹干備用。暴雪等[18]將文冠果種仁油約80 mg置25 mL量瓶中用丙酮溶解并稀釋至刻度。精密量取50 μL，加0.4 mL，0.5 mol/L KOH-CH3OH，振搖1 min，60 ℃水浴30 min。冷卻后，加異丙醇/正庚烷/冰醋酸(40∶10∶1)溶液2.5 mL，渦旋1 min，間斷超聲2 min，室溫下放置10 min，再精密加正庚烷1 mL，水1.5 mL，渦旋1 min，間斷超聲2 min，離心10 min后精密吸取上清液0.5 mL，N2吹干備用。

2.3 三氟化硼方法 三氟化硼方法進(jìn)行甲酯化時(shí)，一般選用三氟化硼-甲醇(BF3/MeOH)溶液。伍金華等[19]優(yōu)選脂肪酸甲酯化方法，在甲酯化試管中依次加入1 mL 正己烷，80 μL含十七烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)物的無水甲醇溶液以及干燥后的細(xì)胞膜沉淀物，混勻后加入14%的BF3/MeOH 2 mL ，立刻充氮?dú)饷芊?。?00 ℃條件下水浴60 min，冷卻后加入0.5 mL 的三蒸水，2 000 r/min離心5 min。取上清液，N2流吹下濃縮至20 μL，-20 ℃保存?zhèn)溆?。Abu等[20]在測量二十碳五烯酸/二十二碳六烯酸指數(shù)時(shí)，將血液處理得到的脂肪酸提取液中加入25%的BF3/MeOH溶液1 mL，在80 ℃水浴條件下加熱60 min，冷卻至室溫后，將脂肪酸甲酯萃取到己烷保存?zhèn)溆谩?/p>

3 脂肪酸檢測的分析方法

3.1 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)方法 對于大多數(shù)的脂肪和脂肪酸而言， GC-MS方法是其最佳的分析方法，也是比較常用的。不同的研究者采用的色譜柱不太相同，其程序升溫等分析條件及檢測到的脂肪酸也不同。吳毅等[21]采用 Inowax(0.32 mm×30 m，0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管色譜柱，程序升溫，初溫110 ℃保持3 min，以2 ℃/min升溫至164 ℃，保持10 min，再以8 ℃/min升溫至210 ℃，保持10 min。檢測到月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、α-亞麻酸、亞油酸、γ-亞油酸等9種脂肪酸。芮雯等[22]以GC-MS方法，采用DB-5色譜柱(30 m×50 μm×0.25 μm)色譜柱，程序升溫為60 ℃，初溫保留2 min，、以30 ℃/min升至120 ℃，再以3 ℃/min升溫至250 ℃，保持20 min。檢測到14種脂肪酸成分，其中蜈蚣藻以棕櫚酸為主，帶形蜈蚣藻以二十碳二烯酸為主。王秀琴等[23]用采用DB-5(60 m×0.25mm，0.25μm)毛細(xì)管色譜柱，程序升溫：柱起始溫度50 ℃，以3 ℃/min升到230 ℃保持20 min檢測到亞油酸、油酸、肉豆蔻酸、棕桐酸、硬脂酸、α-亞麻酸、山崳酸、亞油酸、花生酸、二十碳烯、焦油酸等11種脂肪酸成分。

3.2 高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)方法 近年來一些研究者也嘗試用HPLC-MS方法對某些脂肪酸進(jìn)行分析。采用柱前衍生-高效液相色譜法檢測脂肪酸水平，可以避免氣相色譜法較高柱溫引起的成分不穩(wěn)定。 常用的衍生化試劑有二溴苯乙酮、2-硝基苯肼鹽酸鹽等。王曉麗等[24]以HPLC-MS方法，采用Kromasil C8反相色譜柱(250 mm×416 mm，5 μm)，檢測波長254 nm，以甲醇/乙腈/水(60∶30∶10 )為流動(dòng)相等度洗脫，柱溫為室溫，流速為110 mL/min。一次基線分離得到α-亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、硬脂酸4種脂肪酸，建立注射用沙棘籽油的脂肪酸水平檢測的方法。楊必成等[25]采用YMCJ，sphere ODS-H80(250 mm×4.6 mm，4 μm)色譜柱，乙腈-水梯度洗脫，體積流量為1.00 mL/min，ELSD漂移管溫度85 ℃，氣體為空氣，氣體體積流量為3.0 L/min，柱溫為35 ℃。檢測到亞麻酸酰胺、亞麻酸甘油酯、亞麻酸、棕櫚酸4種脂肪酸化合物。

4 小結(jié)與展望

本文系統(tǒng)總結(jié)了常用的脂肪酸檢測的前處理方法、甲酯化方法、定量分析方法。脂肪酸代謝檢測的標(biāo)本包括動(dòng)物組織、血清、血漿、血紅細(xì)胞、尿液等標(biāo)本；不同的標(biāo)本前處理方法有所不同，即使同一標(biāo)本采用不同的甲酯化方法及分析方法所得的脂肪酸種類和水平也會(huì)有所不同。因此，研究中必須針對不同的實(shí)驗(yàn)對象和實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪M(jìn)行方法優(yōu)選。

常用的前處理方法稱取一定的組織，經(jīng)Folch試劑(氯仿/甲醇=2/1)進(jìn)行勻漿提取脂質(zhì)。由于用氯仿易揮發(fā)，有研究者先用生理鹽水進(jìn)行勻漿，再用氯仿/甲醇進(jìn)行脂質(zhì)提取。

甲酯化方法有酸處理法、堿處理法和三氟化硼法等，其中酸處理法既適于游離脂肪酸，又適合于結(jié)合態(tài)脂肪酸(脂肪)；堿法甲酯化只適合于脂肪；由于三氟化硼法很難將脂類完全提取，不太常用。以硫酸/甲醇溶液進(jìn)行甲酯化方法最為常用，以80 ℃反應(yīng)60 min為最佳反應(yīng)條件。

脂肪酸分析方法以GC-MS、HPLC-MS最為常用。GC-MS法一般需要先將脂肪酸采用酸催化法與堿催化法制備脂肪酸甲酯化產(chǎn)物，具有譜庫大，速度快，節(jié)省流動(dòng)相，普通實(shí)驗(yàn)室即可實(shí)現(xiàn)，成本低等優(yōu)點(diǎn)，因此最為常用，但此方法具有定量不夠準(zhǔn)確，靈敏度欠佳，穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)；HPLC-MS法具有較高的靈敏度，節(jié)省了甲酯化處理過程，近年來比較常用，但需要采用柱前衍生處理，衍生過程需在氫氧化鉀、冠醚及相轉(zhuǎn)移催化劑的存在下于苯或甲苯中完成，進(jìn)樣前需進(jìn)行繁瑣的預(yù)處理，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。

綜合文獻(xiàn)分析，臨床醫(yī)學(xué)上很多疾病和脂肪酸的變化有密切關(guān)系，機(jī)體器官生理和病理變化往往會(huì)引起體內(nèi)脂肪酸成分的改變，檢測機(jī)體中脂肪酸的水平，對研究不同條件下血脂代謝情況，診斷某種脂肪酸水平異常引起的疾病以及調(diào)整補(bǔ)充機(jī)體所需、改善營養(yǎng)療效等方面具有重要意義。因此對脂肪酸代謝的檢測對及時(shí)了解脂肪酸代謝疾病非常重要，更方便、快捷、準(zhǔn)確的脂肪酸檢測方法還有待研究者的進(jìn)一步探討。

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10.3969/j.issn.1672-9455.2015.06.055

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1672-9455(2015)06-0848-02

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△通訊作者，E-mail:wangaw66@163.com。