16SrRNA測序法鑒定致皮下軟組織感染的毗鄰顆粒鏈菌一例

衛(wèi)穎玨， 楊?；郏?秦娟秀

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，上海200001)

顆粒鏈菌屬(Granulicatella)為兼性厭氧的革蘭陽性球菌，是人口咽部、泌尿生殖道和腸道的正常菌群，機(jī)體免疫力低下時可引起感染性心內(nèi)膜炎、中耳炎和菌血癥等。我們近期從1例無肌性皮肌炎患者右上肢皮疹潰瘍中分離出1株毗鄰顆粒鏈菌(Granulicatella adiacens)，現(xiàn)報道如下。

一、病例資料

患者男，64歲，因“確診無肌性皮肌炎3年”于2014年7月7日入住上海仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕科病房。患者主訴自2010年10月開始出現(xiàn)額部、面頰、鼻、頸背部、手指關(guān)節(jié)伸側(cè)紫紅色斑疹，無瘙癢，無關(guān)節(jié)腫痛，無肌力下降，無肌痛，上海華山醫(yī)院2011年1月查抗核抗體(antinuclear antibody，ANA)陽性1∶3 200，抗 Ro52 陽性(+++)，抗干燥綜合征抗原A抗體、抗干燥綜合征抗原B抗體陰性，予強的松和羥氯喹治療，癥狀改善。之后患者病情反復(fù)，仍有四肢及面部紅色斑疹?，F(xiàn)予以強的松 25 mg/d+羥氯喹 0.2/d、甲氨蝶呤10 mg/周治療，患者右上肢皮疹仍紅腫脹痛。

查體:體溫 37℃，脈搏 84次/分，呼吸18次/分，血壓 17.3/9.3 kPa，右手背腫脹明顯。血常規(guī):白細(xì)胞7.2×109/L，中性粒細(xì)胞70.2%。右手背腫脹處潰瘍分泌物細(xì)菌涂片發(fā)現(xiàn)短鏈狀革蘭陽性球菌，醫(yī)囑行分泌物培養(yǎng)。

二、微生物學(xué)檢查及結(jié)果

1.細(xì)菌培養(yǎng) 用無菌拭子采集患者右手背腫脹處潰瘍分泌物，接種血平板、麥康凱平板和巧克力平板(上海伊華醫(yī)學(xué)科技有限公司)，35℃、5.5%CO2培養(yǎng)24h后，血平板上形成灰白色α溶血的細(xì)小菌落。其它平板上無細(xì)菌生長。

2.細(xì)菌鑒定 (1)染色鏡檢:將24h培養(yǎng)物涂片、革蘭染色，鏡下見卵圓形、成雙或短鏈狀排列的革蘭陰性球菌;再將48 h培養(yǎng)物涂片染色，鏡下見類似的革蘭陽性球菌;(2)衛(wèi)星試驗:用金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)做衛(wèi)星試驗，結(jié)果為陽性;(3)上機(jī)鑒定:將24h培養(yǎng)物用法國生物梅里埃VITEK 2 Compact系統(tǒng)NH板條鑒定，結(jié)果為陰道加德納菌89%，生物編碼0237610010。

3.16SrRNA基因測序 鑒于該菌革蘭染色陰陽性不定，上機(jī)鑒定率不高且與實際所送標(biāo)本不符，故應(yīng)用16SrRNA基因測序法進(jìn)一步鑒定。采用天根生化試劑盒提取細(xì)菌DNA作為模板待用。參考引物序列如下:16S rRNA上游引物(F):5'-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，16S rRNA下游引物(R):5'-GGTTACCTT-GTTACGACTT-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為:10×Buffer緩沖液2.5μL;dNTPMix 2μL;TaqDNA聚合酶0.5μL;DNA模板1μL;上下游引物各1μL;ddH2O 17μL;聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增條件為:94℃ 5 min;94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃90 s，32個循環(huán);72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測序，所得序列在NCBI上進(jìn)行比對。經(jīng)序列比對后，鑒定該菌為毗鄰顆粒鏈菌99%，GenBank序列號AY879299.1。

4.診斷與治療 由于該菌表型鑒定困難，至患者出院時細(xì)菌鑒定的最終結(jié)果仍未報告，也未做藥物敏感性試驗［可根據(jù)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)MM45-A2標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性試驗］。臨床醫(yī)生經(jīng)驗性地先后給予左氧氟沙星、異煙肼、美羅培南和多西環(huán)素治療，患者出院時右手背皮下軟組織感染有所好轉(zhuǎn)，但仍有腫脹。

三、討論

1961年FRENKEL等［1］將一種在其它細(xì)菌菌落周圍呈“衛(wèi)星現(xiàn)象”生長的草綠色鏈球菌定義為營養(yǎng)變異鏈球菌(nutritionally variant Streptococcus，NVS)。2000年 COLLINS 等［2］應(yīng)用16SrRNA基因序列研究將NVS重新分為顆粒鏈菌屬和乏養(yǎng)菌屬(Abiotrophia)，其中顆粒鏈菌屬包括毗鄰顆粒鏈菌、挑剔顆粒鏈菌(Granulicatella elegans)、小須鯨顆粒鏈菌(Granulicatella balaenopterae)和副毗鄰顆粒鏈菌(Granulicatella para-adiacens)。

顆粒鏈菌屬對營養(yǎng)要求挑剔，通常只能在含有L-半胱氨酸或吡哆辛的培養(yǎng)基上生長。一般認(rèn)為“吡哆辛依賴試驗”和“衛(wèi)星現(xiàn)象”是關(guān)鍵的手工鑒定方法。目前多應(yīng)用自動化系統(tǒng)來鑒定該菌屬。VITEK 2 Compact系統(tǒng)是新一代的全自動快速微生物鑒定智能分析系統(tǒng)，該系統(tǒng)的GP板條菌種庫中有該菌屬。但由于該菌屬革蘭染色的不確定性，選用正確的板條上機(jī)顯得尤為重要。

16SrRNA基因測序法相比其它細(xì)菌表型鑒定方法具有高效、準(zhǔn)確、特異性強等優(yōu)點。隨著基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，細(xì)菌16S rRNA間隔區(qū)序列數(shù)據(jù)庫不斷擴(kuò)大，使該技術(shù)已成為細(xì)菌分類學(xué)中最重要的方法［3］。2014年KOH等［4］先用VITEK 2 Compact系統(tǒng)，再用16S rRNA基因測序來驗證的方法鑒定出3株毗鄰顆粒鏈菌。因需特殊儀器并外送測序等原因，該技術(shù)目前還不作為常規(guī)的鑒定方法，多用于對全自動鑒定系統(tǒng)的驗證或科學(xué)研究。

臨床治療顆粒鏈菌屬所致感染較為困難［5］，可能是其對一些抗菌藥物耐藥。表型鑒定的低檢出率和耗時過長也增加了診斷及治療的難度。本例患者長期服用免疫抑制劑，屬該菌的易感人群。由于報告滯后，臨床醫(yī)生先后用了4種抗菌藥物，效果均一般。

對于臨床微生物檢驗工作者而言，盡早地檢出顆粒鏈菌將有助于臨床及時診斷和治療。普通培養(yǎng)基上生長不良的鏈球菌，要想到是NVS的可能，加做衛(wèi)星試驗，對鑒定有幫助。有條件的實驗室可應(yīng)用16S rRNA基因測序技術(shù)來幫助鑒定，防止漏檢和誤檢。

［1］FRENKEL A，HIRSCH W.Spontaneous development of L forms of streptococci requiring secretions of other bacteria or sulphydryl compounds for normal growth［J］.Nature，1961，191:728-730.

［2］COLLINSMD，LAWSON PA.The genus Abiotrophia(Kawamura etal.)is not monophyletic:proposal of Granulicatella gen. nov.， Granulicatella adiacens comb.nov.，Granulicatella elegans comb.nov.and Granulicatella balaenopterae comb.nov.［J］.Int J Syst Evol Microbiol，2000，50(Pt 1):365-369.

［3］龍雯，陳存社.16SrRNA測序在細(xì)菌鑒定中的應(yīng)用［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，24(5):10-12.

［4］KOH YR， YI J， KIM HH， etal. Discrepant satellitism for identification of Granulicatella adiacens isolates［J］.Ann Lab Med，2014，34(2):174-176.

［5］BROUQUI P，RAOULT D.Endocarditis due to rare and fastidious bacteria［J］.Clin Microbiol Rev，2001，14(1):177-207.