海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究

劉 騰，符乃光，李澤友

（海南醫(yī)學院藥學院，海南 ?？?571199）

海南水蛭中水蛭素的抗凝活性研究

劉 騰，符乃光，李澤友

（海南醫(yī)學院藥學院，海南 ?？?571199）

目的 分析海南水蛭的品種及其中水蛭素的抗凝作用。方法觀察海南水蛭的形態(tài)特征、薄層色譜圖，并采用凝血酶滴定法測定其抗凝活性。結果海南水蛭為菲牛蛭，水蛭素的抗凝活性分別為：全身1174.8 U/g、頭部6521.7 U/g、身體308.6 U/g。結論海南水蛭具有很好的抗凝血活性，值得進一步研究開發(fā)。

海南水蛭；水蛭素；薄層色譜；凝血酶

中藥水蛭具有抗凝血、抗腫瘤、提高免疫力、降血脂等多種藥理活性，臨床上用于治療多種疾病[1]。2010年版《中國藥典》一部中記載水蛭的品種為“水蛭科動物螞蟥W.pigraWhitman、水蛭H.nipponicaWhitman或柳葉螞蟥W.acranulatawhitman的干燥全體”[2]。螞蟥與柳葉螞蟥經現(xiàn)代研究均含有水蛭素(Hirudin，一種多肽)，具有一定的臨床療效[3]，但二者臨床療效均不如吸血水蛭[4]，吸血水蛭在我國產量相對豐富，是不錯的藥材資源。菲牛蛭(Poecilobdella manillens)是一種吸血水蛭，又稱馬尼擬醫(yī)蛭，俗稱金邊螞蟥。從菲牛蛭中分離出的生物活性成分菲牛蛭素(Bufrudin)也是一種多肽，由60多個氨基酸組成，分子量7000 Da，氨基酸殘基序列有50%～60%與水蛭素相同。它的作用機理與水蛭素、森林山蛭素(Haemadin)相同，都是抑制凝血酶[5]。張彬等[6]對菲牛蛭的抗凝血作用的研究表明菲牛蛭具有較強的體外抗凝血酶活性，且人工養(yǎng)殖對菲牛蛭的抗凝活性未產生不利影響。

隨著水蛭臨床應用的廣泛，醫(yī)藥市場對水蛭的需求量越來越大，進而對水蛭進行相關研究的文獻也越來越多，尤其是對廣西菲牛蛭的研究。菲牛蛭生活于水田、水溝或池塘里，主要吸食人、畜血液，造成嚴重危害，是海南島水田的優(yōu)勢種，密度很大[7]。海南地區(qū)溫濕度條件非常適合水蛭的生長，水蛭分布密度較廣，但至今還沒有對海南野生水蛭研究的相關文獻，因此，我們對海南野生水蛭進行鑒別及體外抗凝活性測定，以探討海南野生水蛭作為一種抗凝抗栓藥物的運用前景，為海南水蛭的養(yǎng)殖、開發(fā)和應用打下理論基礎。

1 試劑與儀器

1.1 材料與試劑 海南野生水蛭(海南屯昌縣水田抓獲)，干燥寬體金線蛭(海南國瑞堂中藥制劑有限公司，產地：廣西，楊衛(wèi)麗副教授鑒定)，廣西菲牛蛭粉末(養(yǎng)殖戶贈送)。人纖維蛋白原(博雅制藥，規(guī)格0.5 g/瓶，批號：20131220)，凝血酶凍干粉(湖南一格制藥，規(guī)格500單位，批號：121112-4)，三羥甲基甲烷(西亞試劑，批號：B92407)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 冷凍干燥器(CHRIST、型號：ALPHA1-2LD Plus)，粉碎機(黃城，永康市天祺盛世工貿有限公司)，KQ2200E醫(yī)用超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，飛鴿牌系列TGL-16G離心機(上海安亭科學儀器廠)，電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司、型號：DK-98-Ⅱ)，精密pH計(PHS-2C，上海大普儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 海南野生水蛭的鑒別

2.1.1 形態(tài)特征 個體狹長且扁平，活的背面呈黃褐色，背中有一條不顯著地斷裂的藍灰色縱紋，個體較大，進食前最大的體長約110mm，最大體寬12mm，尾部明顯小于體寬，尾吸盤背面有分散的不規(guī)則色斑，體正側面各有一條橙黃色的縱帶。腹面淡灰色，無斑點及縱紋。

2.1.2 干燥粉碎 將活水蛭室溫下加入一定量生理鹽水，浸泡30min后蒸餾水充分清洗，-80℃低溫冰箱迅速凍死，后將其放置在零下15℃～20℃的冷凍冰箱中進行預凍48 h，至其周圍的冰霜有約5mm厚，然后將其迅速放置于真空冷凍干燥設備中，干燥12 h。干燥后的水蛭粉碎處理，得粉末備用。

2.1.3 TLC鑒別[8](1)供試液的制備：取上述水蛭粉末約100 mg，加入1ml生理鹽水，超聲波提取30min，離心10min(1000 r/min)，取上清液在80℃水浴加熱2min備用，用1ml生理鹽水做同樣處理作為空白溶液。(2)層析板處理：取硅膠G板，105℃活化1 h。(3)薄層條件：將一定量的樣品溶液和空白溶液分別用微量注射器點于同一薄層板上，用正丁醇-冰乙酸-水(3.5：2：4.5)為展開劑，立式上行展開12cm，取出，揮去溶劑后噴灑0.2%茚三酮丙酮溶液，在105 C下加熱15min，顯出紫紅色斑點，如圖1。由海南水蛭的形態(tài)特征和薄層圖譜顯示可知，海南水蛭是菲牛蛭。

圖1 水蛭的薄層色譜

2.2 凝血酶滴定法測定抗凝活性

2.2.1 提取液的制備 分別精密稱取水蛭的全身和各自的頭部及身體粉末各約1 g，精密加入0.9%氯化鈉溶液10ml，充分攪拌，浸提30min，并時時振搖，10000 r/min離心15min，分離上清液，用1.0 mol/L NaCl溶液調節(jié)其pH值為5.0[9]，備用。

2.2.2 緩沖液的配制 取0.2 mol/L三羥甲基氨基甲烷溶液25ml與0.1 mol/L鹽酸溶液40ml，加水至100ml，調節(jié)其pH值為7.4，加入0.5 g(人)纖維蛋白原溶解，即得含0.5%(人)纖維蛋白原的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液。

2.2.3 凝血酶滴定液的配制[10]將100 NIH/ml的凝血酶加入不同體積的0.9%氯化鈉溶液，配成不同濃度的凝血酶滴定液。

2.2.4 抗凝血活性測定 分別精密量取水蛭的全身、頭部和身體提取液100 μl，置試管(10mm×100mm)中，加入含0.5%(人)纖維蛋白原200 μl，搖勻，置水浴(37±0.5)℃中緩緩滴加凝血酶溶液(5 μl/min，對照液用2 μl/min，邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積。

按下式計算含量：U=C1×V1/(C2×V2×W)式中：U為每1 g含凝血酶活性單位(U/g)；C1為凝血酶溶液的濃度(U/ml)；C2為供試品溶液的質量濃度(g/ml)；V1為消耗凝血酶溶液的體積(μl)；V2為供試品溶液的加入量(μl)；W為取樣量，抗凝活性測定，見表1。

表1 海南水蛭的抗凝活性測定結果

3 討 論

3.1 色譜條件的優(yōu)化 參考丁家欣等[8]的薄層色譜條件，海南水蛭的圖和廣西菲牛蛭的圖幾乎一致，但和寬體金線蛭的色譜圖區(qū)分度也不高。多次實驗顯示菲牛蛭有時會在溶劑前沿出現(xiàn)一個黃棕色斑點和在比移值為0.81左右出現(xiàn)一個很微弱很淡的淺紫色斑點；但即使在相同的條件下重復試驗，這兩個斑點也是時有時無，出現(xiàn)的概率大約為30%。故此，我們對條件進行了改進，把提取的TLC供試液均在80℃的水浴中加熱2min，然后進行展開顯色，色譜圖的斑點則表現(xiàn)出較高的區(qū)分度。在對提取液加熱的過程中，寬體金線蛭提取液出現(xiàn)少量白色沉淀，溶液未變色，菲牛蛭提取液從黑褐色變成棕褐色，且出現(xiàn)大量沉淀。但加熱后的上清液均不影響點樣和顯色。

3.2 薄層色譜的區(qū)別 在TLC圖譜中，菲牛蛭在前沿有一棕黃色斑點，Rf0.95左右，寬體金線蛭無。而寬體金線蛭在Rf0.62左右有一深紫色斑點，菲牛蛭無，可以區(qū)別兩種水蛭品種。

3.3 活性測定的條件及優(yōu)化 抗凝活性測定時，1 g水蛭粉用10ml0.9%NaCl提取和10000 r/min離心15min后效果較好，可以獲取澄清的提取液。并且提取液的pH值約為5.5，本身就有利于含量測定的順利進行，所以滴定時不需再用NaOH溶液調節(jié)其pH。水蛭中的水蛭素主要濃集在頭部，身體部位的水蛭素含量很少，本試驗結果也反映了這一點；如果在測定時滴加凝血酶過快則會導致結果偏低，且身體部位的提取液為深褐色導致剛剛出現(xiàn)白色絮狀沉淀時很難發(fā)現(xiàn)。所以，延緩滴加凝血酶的間隔時間，采用每隔2min滴加一次，并且適當降低凝血酶濃度，這樣可以使滴定終點準確快速的確認和測量結果更加準確可信。

[1]周 樂,趙文靜,常惟智.水蛭的藥理作用及臨床應用研究進展[J].中醫(yī)藥信息,2012,29(1)：132-133.

[2]曾元兒.中國藥典.一部[S].2010：77-78.

[3]楊洪雁,杜智恒,白秀娟.水蛭藥理作用的研究進展[J].東北農業(yè)大學學報,2012,43(3)：128-133.

[4]來復根,金永昌.中藥水蛭原動物的本草學考證[J].現(xiàn)代應用藥學,1988,5(1)：15.

[5]Electricwala A.Isolation of thrombin inhibitor from the Leech Hirudinaria manillenaia[J].Blood Coagulation and Fibrinolysis,1991,2 (1)：83-89.

[6]張 彬,汪 波,龔 元,等.幾種水蛭抗凝血物質提取及活性分析[J].中山大學學報：自然科學版,2012,51(4)：92-96.

[7]楊 潼.中國動物志蛭綱[M].北京：科學出版社,1996：120-122.

[8]丁家欣,張秋海,歐興長,等.三種水蛭的薄層色譜與電泳法鑒別[J].中藥材,1994,17(11)：279-281.

[9]范尚坦,李金蘭,張 勇,等.水蛭中水蛭素含量測定的改進[J].中國中藥雜志,2008,33(19)：2277-2279.

[10]盧舒凡,李慶國,許淑芹.廣東菲牛蛭中有效抗凝物質的分離純化[J].醫(yī)學研究雜志,2014,43(5)：104-107.

Study on anticoagulant activity of hirudin in Hainan leech.

LIU Teng,FU Nai-guang,LI Ze-you.School of Pharmacy,Hainan Medical University,Haikou571199,Hainan,CHINA

ObjectiveTo analyze the species of Hainan leeches and the anticoagulant activity of hirudin.MethodsThe morphological characteristics and thin-layer chromatogram of Hainan leech were observed.Then anticoagulant activity was measured with the method of thrombin titration.ResultsHainan leeches were Hirudinaria manillensis.The anticoagulant activity of Hainan Leech hirudin was1174.8 U/g of whole body,6521.7 U/g of the head and308.6 U/g of the body.ConclusionHainan leeches have very good anticoagulant activity,which deserve further research and development.

Hainan leech;Hirudin;Thin-layer chromatogram(TLC);Thrombin

R282.74

A

1003—6350（2015）16—2345—03

2015-03-07)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.16.0847

海南醫(yī)學院大學生創(chuàng)業(yè)項目(編號：HYCX201240)

李澤友。E-mail：lzy7307@126.com