前列腺素E2在川崎病患者血漿中的表達及臨床意義

楊燕瀾，武宇輝，黃雀蘭，李成榮，王國兵，馬偉科

(深圳市兒童醫(yī)院內(nèi)二科，廣東 深圳 518026)

前列腺素E2在川崎病患者血漿中的表達及臨床意義

楊燕瀾，武宇輝，黃雀蘭，李成榮，王國兵，馬偉科

(深圳市兒童醫(yī)院內(nèi)二科，廣東 深圳 518026)

目的 觀察前列腺素E2(PGE2)在川崎病(KD)患兒血漿中的表達水平并探討其臨床意義。方法選擇2013年5月至2014年10月在我院住院的35例KD急性期患兒，在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)治療前后采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血漿PGE2水平，實時熒光定量PCR法測定外周血CD14+單核/巨噬細胞(MC)環(huán)氧化酶-1(COX-1)、環(huán)氧化酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平。另選15例健康同齡兒童作為對照組，測定上述指標。結果KD急性期患兒血漿PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；KD患兒中的冠狀動脈病變組PGE2、COX-2水平高于無冠狀動脈病變組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但COX-1、TNF-α、IL-6比較則差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IVIG治療后PGE2、COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平較治療前均降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論KD急性期患兒血漿PGE2水平升高，其可能在KD的炎癥免疫反應和氧化應激中發(fā)揮重要作用。

川崎病；前列腺素E2；環(huán)氧化酶-2

川崎病(Kawasaki disease，KD)又被稱為黏膜皮膚淋巴結綜合征(Mucocutaneous lymphnode syndrome，MCLS)，是兒科常見的全身血管炎性疾病。少部分未經(jīng)治療的患兒可發(fā)生冠狀動脈損害甚至形成動脈瘤。目前發(fā)病機制仍不十分清楚，流行病學及臨床研究提示KD可能為感染引起的急性免疫調(diào)節(jié)紊亂，進一步導致血管壁損傷[1]。近年來，前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)在炎癥反應和免疫中的作用得到越來越多的關注，在炎癥急性期的血管病變可能與PGE2有關[2-3]。已經(jīng)有學者關注到PGE2在川崎病患者血液中表達的改變[4-5]。本文旨在觀察PGE2在KD患兒血漿中的表達水平并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按照國內(nèi)川崎病的診斷標準[6]，收集2013年5月至2014年10月在我院住院的35例初次發(fā)病的KD患兒，年齡1～7歲，平均3.72歲，男性20例，女性15例，漢族。治療過程中心臟彩超動態(tài)觀察患者冠狀動脈的改變情況。若5歲以下兒童冠狀動脈內(nèi)徑>3 mm，5歲或5歲以上兒童冠狀動脈內(nèi)徑>4 mm；或者冠狀動脈局部內(nèi)徑較鄰近處大于或等于1.5倍者，考慮合并冠脈損傷[6]。依據(jù)心臟彩超結果把患者分為有冠脈病變組14例和無冠脈病變組21例。另外收集15例健康兒童作為對照組，年齡1～6歲，平均3.94歲，男性9例，女性6例。KD組和對照組的性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究通過醫(yī)院倫理委員會的批準，所有受試者家屬對試驗知情同意。

1.2 方法

1.2.1 血標本收集及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 在靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)治療前(病程10 d內(nèi))和治療后第3天(且體溫正常)分別肝素抗凝管留取KD患兒外周血標本2 ml，并立刻送檢。800 rpm離心10 min分離上層血漿，雙抗體夾心ELISA(Bender MedSystem公司試劑盒)測定前列腺素E2水平，具體按照試劑盒說明書步驟操作。

1.2.2 實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)(1)單核/巨噬細胞(MC)總RNA的提取與定量：乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·Na2)抗凝管留取靜脈血3 ml，聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(P=1.077)密度梯度離心法分離外周血單核細胞。免疫磁珠(美國Invitrogen公司，111.49 D)分離外周血CD14+MC。進一步分離總RNA(Ambion公司試劑盒，AM1912)，紫外分光光度計測定RNA含量，-80℃冰箱保存。(2)RT-PCR：參照說明書步驟逆轉錄合成cDNA(立陶宛MBI公司試劑盒，K1632)，取1 μl cDNA為模板，所需引物向上海英駿生物技術有限公司訂購合成(引物序列及PCR參數(shù)見表1)，PCR擴增30～40循環(huán)。(3)RT-PCR產(chǎn)物鑒定：取COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6等及β-action擴增產(chǎn)物10 μl在2%瓊脂糖凝膠中，90 V電泳30 min，回收純化，送交invitrogen公司測序。測序結果與Genebank中目的基因mRNA序列比較，擴增產(chǎn)物與目的基因序列完全一致。(4)Real-Time PCR：使用羅氏LightCycler480Ⅱ熒光定量PCR儀(德國QIAGen公司SYBRGreen試劑盒，204143)，采用Relative Quantification Software Ver1.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析。以待測基因/β-action的CT比值表示結果。

表1 RT-PCR、熒光實時定量PCR引物

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS13.0軟件包進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，方差齊性檢驗后用t檢驗比較兩組之間的差異，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。符合正態(tài)分布的兩組數(shù)據(jù)的相關性使用Pearson相關分析。

2 結 果

2.1 IVIG治療前后和對照組血漿PGE2水平 KD急性期患兒IVIG治療前血漿PGE2水平顯著高于對照組[(18.48±3.57)pg/ml vs(6.90±1.77)pg/ml，t=11.89，P=0.000]；IVIG治療后下降[(9.74±2.71)pg/ml vs(18.48±3.57)pg/ml，t=12.73，P=0.000]，見圖1。KD-有冠狀動脈病變組患兒血漿PGE2水平高于KD-無冠狀動脈病變組[(19.95±3.74)pg/ml vs (17.50±3.17)pg/ml，t=2.09，P=0.045]，見圖2。

2.2 KD患兒治療前后外周血MC COX-1、COX-2、IL-6、TNF-α水平 KD患兒IVIG治療前COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均較對照組兒童上升，IVIG治療后COX-1、COX-2、TNF-α、IL-6水平均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表2。KD患兒中的冠狀動脈病變組COX-2水平高于無冠狀動脈病變組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而兩組TNF-α、IL-6、COX-1水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.3 IVIG治療前血漿PGE2水平和COX-2、TNF-α水平的相關性 KD急性期患兒IVIG治療前PGE2水平和CD14+MC的COX-2、TNF-α水平均較正常對照組升高，血漿PGE2水平與COX-2、TNF-α水平均呈正相關(r=0.652，P=0.000；r=0.648，P=0.000)，見圖3。

圖1 KD患兒IVIG治療前后和對照組血漿PGE2水平(±s)

圖2 KD有冠脈病變和無冠脈病變組患兒血漿PGE2水平(±s)

表2 KD組IVIG治療前后和對照組樣本基因表達相對定量比較(±s)

表2 KD組IVIG治療前后和對照組樣本基因表達相對定量比較(±s)

注：均采用熒光定量PCR檢測，結果以待測基因/β-action的比值表示。aKD組IVIG治療前后比較，P＜0.05；bKDIVIG前與對照組比較，P＜0.05；cKDIVIG后與對照組比較，P＜0.05。

組別KDIVIG前組KDIVIG后組對照組COX-1(×10-4) 23.82±6.90ab13.24±5.63 14.87±6.72 COX-2(×10-2) 25.09±11.31ab14.20±5.54 11.67±4.50 IL-6(×10-4) 46.65±25.04ab24.95±16.69c2.74±1.07 TNF-α(×10-3) 113.69±46.11ab76.74±27.15c5.87±2.42

表3 KD組IVIG治療前樣本基因表達相對定量比較(±s)

表3 KD組IVIG治療前樣本基因表達相對定量比較(±s)

組別KD-有冠狀動脈病變組KD-無冠狀動脈病變組t值P值COX-1(×10-4) 22.15±5.03 23.37±5.79 0.641 0.864 COX-2(×10-2) 28.00±14.56 22.29±8.67 1.458 0.015 IL-6(×10-4) 47.21±18.51 46.91±23.72 0.041 0.572 TNF-α(×10-3) 118.86±56.52 103.52±33.80 1.006 0.215

圖3 KD組IVIG治療前血漿PGE2水平和CD14+MC COX-2、TNF-α水平的關系

3 討 論

川崎病是一種急性自身免疫性血管炎綜合征，以亞裔人發(fā)病率為高，常見于＜5歲兒童[7]。本病為自限性疾病，多數(shù)預后良好，但部分患兒可引起全身多系統(tǒng)受累，最嚴重的就是冠狀動脈損害，是兒童獲得性心臟病常見的病因之一，甚至成年后遺留嚴重后遺癥[8]。目前研究認為，感染導致T細胞、MC等免疫活性細胞異?；罨a(chǎn)生的一系列炎癥細胞因子，可能在KD患兒的血管內(nèi)皮損傷過程中發(fā)揮重要作用并干擾自身免疫耐受[9]。我們課題組前期的研究也證實了川崎病急性期外周血單核細胞大量分泌NF-κB，介導炎癥細胞因子過度產(chǎn)生[10]。此外，近年來研究顯示，氧化應激因素可能參與了KD患者血管內(nèi)皮損傷的發(fā)生發(fā)展[11-13]。

PGE2是產(chǎn)花生四烯酸環(huán)氧化酶途徑的代謝產(chǎn)物之一，主要由MC產(chǎn)生，是機體應激條件下參與免疫調(diào)節(jié)的重要介質。PGE2通過受體的相互協(xié)同及拮抗作用，參與機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持，如調(diào)控T細胞、引起血小板聚集。PGE2在炎癥發(fā)展的不同階段發(fā)揮不同的作用，可以在致炎和抗炎兩個方向上參與整個調(diào)節(jié)過程[14-15]。研究數(shù)據(jù)顯示，在早期炎癥反應階段，通過EP2受體，前列腺素E2在人冠狀動脈內(nèi)皮細胞誘導β1-整合素活化，發(fā)揮促炎作用[5]。炎癥過程中PGE2通過與緩激肽、5-羥色胺、組胺等介質在炎癥部位相互作用，引起血管尤其是冠狀動脈擴張，增加血管通透性，并產(chǎn)生致熱源引起發(fā)熱，參與炎癥急性期的血管反應。此外，氧化應激反應過程中也有PGE2的參與[16]。

本研究的結果顯示，KD急性期患兒外周血中PGE2水平高于健康同齡對照組兒童(P＜0.05)，與CD14+MC中的炎癥因子TNF-α水平正相關，而且急性期存在冠狀動脈病變的KD患者較未發(fā)生冠狀動脈病變的KD患兒血漿中PGE2水平升高(P＜0.05)，患兒在IVIG治療后PGE2水平較治療前下降(P＜0.05)，提示PGE2參與了KD的發(fā)病機制并發(fā)揮著促炎作用，KD患兒血管炎的發(fā)生可能和其有關。大劑量IVIG通過降低急性期KD患兒PGE2水平，減少了氧化應激所致的冠脈損傷[17]。

環(huán)氧化酶(COX)是合成PGE2的主要限速酶，分為環(huán)氧酶-1(COX-1)和環(huán)氧酶-2(COX-2)二種異構酶。COX-1在體內(nèi)呈生理性表達，催化PGE2合成，臨床上常在KD急性期廣泛使用COX-1抑制劑阿司匹林對抗血小板聚集[18-19]。本組中KD患兒在IVIG治療后COX-1水平明顯下降，考慮可能與KD組患兒在IVIG治療后已經(jīng)使用了數(shù)天大劑量阿司匹林有關。COX-2是COX-1的異構體，存在于多種類型細胞中，通常在正常生理狀態(tài)下沒有活性，在病理狀態(tài)或應激狀態(tài)下受NF-κB等炎癥介質誘導激活，參與炎癥、腫瘤的發(fā)生發(fā)展[20-21]。本研究結果進一步證實在KD急性期患兒外周血MC的COX-2顯著升高，有冠狀動脈病變的KD患兒COX-2和PGE2均水平高于無冠狀動脈病變患者，且PGE2水平和CD14+MC的COX-2水平呈正相關。

總之，通過本研究我們發(fā)現(xiàn)KD急性期血漿PGE2水平升高，可能參與了KD冠脈病變過程，而IVIG治療可下調(diào)COX-2表達，從而降低PGE2水平，在KD治療過程中發(fā)揮抗血管炎、抗氧化應激等作用。

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Changes and significance for prostaglandin E2level in plasma of patients with Kawasaki disease.

YANG Yan-lan, WU Yu-hui,HUANG Que-lan,LI Cheng-rong,WANG Guo-bing,MA Wei-ke.The Second Department of Medicine, Shenzhen Children's Hospital,Shenzhen 518026,Guangdong,CHINA

Objective To observe the prostaglandin E2(PGE2)level in plasma of patients with Kawasaki disease(KD)and discuss the clinical significance.MethodsThirty-five patients with KD which treated in our hospital from May 2013 to October 2014 were selected.The plasma concentrations of PGE2were analyzed by ELISA technique.Real-time quantitative PCR was used to evaluate the expression level of cyclooxygenases-1(COX-1),cyclooxygenases-2(COX-2),tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin-6(IL-6)on CD14+monocyte/macrophage cells (MC)before and after intravenous immunoglobulin(IVIG).Fifteen healthy children were selected as the control group,with the above indicators measured.ResultsThe levels of PGE2,COX-1,COX-2,TNF-αand IL-6 in acute KD patients were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),and they were down-regulated after IVIG(P＜0.05).The level of PGE2and COX-2 in KD patients with coronary artery lesion were significantly higher than those without coronary artery lesion(P＜0.05),and there were no statistically significant difference in COX-1, TNF-αand IL-6 between the two groups(P>0.05).ConclusionProstaglandin E2level in plasma of patients with KD is up-regulated and may play an important role in inflammatory and immune response and oxidative stress.

Kawasaki disease;Prostaglandin E2;Cyclooxygenases-2

R442.8

A

1003—6350（2015）18—2675—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.18.0973

2015-03-15)

2013年深圳市醫(yī)療衛(wèi)生類科研項目(編號：201303057)

李成榮。E-mail：418027143@qq.com