人體肝癌細(xì)胞系SMMC-7721非顯帶技術(shù)下的核型分析

范 寧，高 磊，汪 艷，米亞靜，景曉紅

(1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，陜西 西安710021)

人體肝癌細(xì)胞系SMMC-7721非顯帶技術(shù)下的核型分析

范 寧1，高 磊1，汪 艷1，米亞靜2，景曉紅2

(1.西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021；2.西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，陜西 西安710021)

目的應(yīng)用非顯帶技術(shù)，分析人體肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的染色體核型。方法體外培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞，通過秋水仙素使細(xì)胞同步化，低滲、滴片、吉姆薩染色，進(jìn)行非顯帶染色體核型分析。結(jié)果數(shù)目方面，SMMC-7721細(xì)胞系核型的眾數(shù)為60～70條，峰值主要出現(xiàn)在E組，通過分析染色體數(shù)目在50～70個(gè)之間的較清晰的25個(gè)核型發(fā)現(xiàn)，E、F、G組染色體總數(shù)大多過半甚至超過60%；結(jié)構(gòu)方面，分辨出雙著絲粒染色體、含有3個(gè)著絲粒的染色體和環(huán)狀染色體。結(jié)論上述染色體的數(shù)目異常與結(jié)構(gòu)畸變，對認(rèn)識肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、惡變以及臨床的初步診治提供了細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

SMMC-7721；非顯帶；核型分析；超二倍體

原發(fā)性肝癌是一種危害性較大的惡性腫瘤，過去對肝癌的研究，多采用由致癌劑誘發(fā)的肝癌動(dòng)物模型，但這種動(dòng)物的肝癌模型畢竟和人體肝癌的生物學(xué)特性存在著相當(dāng)大的差異[1]。因此，我們通過體外培養(yǎng)人體肝癌細(xì)胞株SMMC-7721，利用非顯帶技術(shù)對其進(jìn)行染色體核型分析，為認(rèn)識肝癌細(xì)胞的遺傳學(xué)特性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) SMMC-7721傳代培養(yǎng)2～3 d，待細(xì)胞生長密度為70%～80%，加1μg/ml秋水仙素作用4～6 h。胰酶消化細(xì)胞，用1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清終止消化，離心，棄去上清液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗細(xì)胞1次，再離心，棄上清。

1.2 低滲處理 加入0.075 mol/L KCl低滲液至6ml，輕輕混勻，37℃水浴20min。

1.3 預(yù)固定 加入固定液(甲醛:冰醋酸=3:1)1ml，輕輕混勻。預(yù)固定2min，1500 r/min離心10min，棄去上清液，保留底部細(xì)胞。

1.4 固定 加入固定液至8ml，混勻固定30min，1500 r/min離心8min，棄去上清液。重復(fù)固定一次。

1.5 滴片 加至1ml固定液制成細(xì)胞懸液，懸空15～20cm滴1～2滴細(xì)胞懸液至冰水中取出的載玻片上，迅速過酒精燈火焰烤片3～5min。

1.6 染色 在標(biāo)本上加數(shù)滴吉姆薩染液，染色20～30min，用水沖洗。

1.7 顯微鏡觀察 在低倍鏡下找到短小似棒狀處于分裂中期細(xì)胞的染色體，轉(zhuǎn)換油鏡繼續(xù)觀察，選擇染色體分散、沒有重疊且團(tuán)聚性較好的細(xì)胞，通過圖像采集系統(tǒng)Motrc Images Advanced3.2鏡下采圖，拍照，計(jì)數(shù)，分析腫瘤細(xì)胞染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

本次標(biāo)本共采集了153個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體分析，肝癌細(xì)胞系SMMC-7721在傳代培養(yǎng)過程中仍保持其上皮細(xì)胞的形態(tài)。

2.1 數(shù)目方面 在153個(gè)核型中：①SMMC-7721細(xì)胞系染色體數(shù)目的眾數(shù)出現(xiàn)在60～70條(圖1)。②擁有65條染色體的細(xì)胞21個(gè)，68條染色體的細(xì)胞9個(gè)。我們進(jìn)一步分析了染色體數(shù)目在50～70個(gè)之間的較清晰的25個(gè)核型發(fā)現(xiàn)。③C組染色體的數(shù)目在A、B、C、D組中最多。④各細(xì)胞中數(shù)目異常的峰值多出現(xiàn)在E組(表1)。⑤E、F、G組染色體總數(shù)40%～50%4個(gè)，50%～60%15個(gè)，60～70%6個(gè)，大多達(dá)到50%甚至超過60%。

圖1 SMMC-7721非顯帶核型中染色體的數(shù)目分布

表125個(gè)核型中E、F、G組染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)表

圖2 SMMC-7721非顯帶核型中染色體的結(jié)構(gòu)異常

2.2 結(jié)構(gòu)方面 在非顯帶技術(shù)下，標(biāo)本中可見1～4個(gè)數(shù)目不等的雙著絲粒染色體(圖2A)、三著絲粒染色體(圖2B)以及環(huán)狀染色體(圖2C)。其中，具有1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)雙著絲粒染色體異常的核型個(gè)數(shù)為9個(gè)、7個(gè)、3個(gè)、1個(gè)，具有三著絲粒染色體的核型個(gè)數(shù)為5個(gè)，具有環(huán)狀染色體異常的核型個(gè)數(shù)為10個(gè)。

3 討 論

關(guān)于SMMC-7721細(xì)胞系的染色體數(shù)目變化，分析結(jié)果較董榮春等[1]在染色體數(shù)目上有不同程度的增加，這可能是不同實(shí)驗(yàn)室獲得同一個(gè)細(xì)胞株后，在離體培養(yǎng)和傳代過程中細(xì)胞發(fā)生演變造成的，還發(fā)現(xiàn)有近90%(137/153)的標(biāo)本其染色體屬于超二倍體，可能與肝癌細(xì)胞在有絲分裂時(shí)染色體不分離或染色體缺失有關(guān)，而無絲分裂、核內(nèi)不均等分裂也可能參與了數(shù)目畸變的形成[2]。而核型數(shù)為(65,68)的標(biāo)本出現(xiàn)的頻率較高，可能是在此狀態(tài)下更有利于肝癌細(xì)胞的存活。關(guān)于為何在25個(gè)核型里C組染色體數(shù)目在A、B、C、D組中最多，已有文獻(xiàn)報(bào)道，C組內(nèi)的8號染色體存有癌基因，11號染色體的長臂是斷裂重接位點(diǎn)，已知該位點(diǎn)既是頻發(fā)斷裂點(diǎn)又是脆性位點(diǎn)和癌基因位點(diǎn)，因此，8號與11號染色體均以較高的頻率參與腫瘤染色體的重排[3]。關(guān)于為何在25個(gè)核型中E組出現(xiàn)峰值以及E、F、G組染色體總數(shù)大多過半甚至超過60%，我們分析，前者可能是因?yàn)镋組的17號染色體長臂含有脆性位點(diǎn)17q11，而該位點(diǎn)與癌基因位點(diǎn)eib-A-1相近，參與肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和癌變[4]；后者可能是由于A、B、C大染色體組的染色體缺失、斷裂從而形成了近似E、F、G組大小的染色體，而這些染色體中同樣含有較多的癌基因和脆性位點(diǎn)，共同導(dǎo)致了肝細(xì)胞的惡變[5]。

從結(jié)構(gòu)上看，出現(xiàn)了雙著絲粒染色體，分析是由于非同源染色體的缺失斷裂之后，含有著絲粒的染色體兩兩組合形成的。至于出現(xiàn)含有三個(gè)著絲粒的染色體，一方面可能是因?yàn)樵诜秋@帶技術(shù)下將扭曲或粘連的染色體誤認(rèn)為含有三個(gè)著絲粒的染色體，另一方面也可能是因?yàn)閮蓷l染色體在形成過程中各自末端缺失，第三條染色體兩個(gè)末端均有缺失，繼而這三條染色體的四個(gè)粘性末端連在一起。由于含有三個(gè)著絲粒染色體的細(xì)胞屬于不穩(wěn)定性染色體畸變，在其傳代以及生長時(shí)，將會(huì)因?yàn)榛蛑貜?fù)、缺失以及形成新的結(jié)構(gòu)畸變而造成對細(xì)胞個(gè)體致命的損傷。環(huán)狀染色體的出現(xiàn)可能是因?yàn)橐粭l染色體的長臂和短臂均出現(xiàn)缺失形成粘性末端[2]，而后相連形成環(huán)狀，或者染色體在復(fù)制分裂過程中兩條姐妹染色單體同側(cè)缺失形成粘性末端后自身相連成為部分環(huán)狀。然而，上述數(shù)目異常和結(jié)構(gòu)異常發(fā)生的確切原因，有待于進(jìn)一步的染色體顯帶或FISH等技術(shù)確定。

通過上述研究，分析肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化、惡變的可能過程是：大染色體含有較多的脆性位點(diǎn)和癌基因[1]，進(jìn)而頻發(fā)斷裂形成粘性末端并暴露癌基因，然后發(fā)生重組，形成等臂、雙著絲粒染色體[2]，促使原癌基因激活，最終加速細(xì)胞惡變[6-8]。上述關(guān)于腫瘤細(xì)胞染色體的核型分析將對肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，癌變提供一定的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)。

[1]董榮春,周榮華,呂發(fā)度,等.SMMC-7721人體肝癌細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性的初步觀察[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1980,1(1):5-9.

[2]左 伋.人類染色體//何俊林.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)[M].6版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013:104-116.

[3]周后龍,鞏 麗,張 偉,等.原發(fā)性肝癌8號和16號染色體雜合子丟失的研究[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2012,20(6):1134-1137.

[4]李福才,孫開來,李呈姜,等.人體肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的高分辨染色體研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1988,17(4):259-263.

[5]曹 巖,劉 紅,劉永紅.肝癌患者淋巴細(xì)胞染色體脆性部位與原癌基因的相關(guān)性[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006,32(4):662-664.

[6]曹來蓉,張超英,紀(jì) 靜.脆性部位與原癌基因在乙型肝炎患者中的相關(guān)性[J].青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2000,36(2):101-103.

[7]王 娟,倪 虹,陳 力,等.肝癌細(xì)胞的染色體變異[J].國外醫(yī)學(xué):遺傳學(xué)分冊,2004,27(2):90-92.

[8]李生平,王輝云,張昌卿,等.原發(fā)性肝癌全基因組雜合性缺失的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2000,80(8):577-581.

Karyotype analysis of human hepatoma cell line SMMC-7721 using non-banding techniques.

FAN Ning1,GAO Lei1,WANG Yan1,MI Ya-jing2,JING Xiao-hong2.1.Department of Clinic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA;2.Department of Basic Medicine,Xi'an Medical University,Xi'an710021,Shaanxi,CHINA

ObjectiveTo analyze karyotype of human hepatoma cell lines SMMC-7721 using non-banding technique.MethodsSMMC-7721 cells were culturedin vitro,followed by cell synchronization with colchicine,hypotonic treatment and Giemsa staining,and then non-banding karyotype was analyzed.ResultsThe majority number of karyotypes of SMMC-7721 cell lines was60 to70.Peaks occurred mainly in the E group,and the majority of E,F,G groups were more than half of the total number of chromosomes or even more than60%(25/128).For the structure of chromosomes,dicentric chromosome,chromosome sharing three centromeres and ring chromosome could be found in a few cells.ConclusionThe analysis of the abnormal chromosome will help us to deeply understand transformation and deterioration of liver cells,which provides the genetic basis for preliminary clinical diagnosis and treatment.

SMMC-7721;Non-banding;Karyotype analysis;Hyperdiploid

R735.7

A

1003—6350（2015）20—2967—03

2015-05-13)

10.3969/j.issn.1003-6350.2015.20.1081

西安醫(yī)學(xué)院校級重點(diǎn)學(xué)科細(xì)胞生物學(xué)、西安醫(yī)學(xué)院校級精品資源共享課程(編號：XYZL2014-3)；陜西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃(編號：201211840010、201211840011)；陜西省優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)資助

景曉紅。E-mail：Jingxh666@163.com