棗根際解磷細(xì)菌的分離篩選及16S rDNA鑒定

郭藝鵬，王海儒，孫林琦，張晶晶，韓 超，秦韻婷，李建貴

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林業(yè)研究所，新疆烏魯木齊830052;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，新疆紅棗工程技術(shù)研究中心，新疆烏魯木齊830052)

磷是植物營養(yǎng)中的三大要素之一，又是植物體內(nèi)有機(jī)化合物的重要組成成分，對其生長發(fā)育都起著不可忽視的作用［1-3］，中國有74% 的耕地土壤缺磷，土壤中95%的磷為無效形式，為了實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)，每年都向土壤中反復(fù)施加大量可溶性磷肥，然而，由于土壤的固定等作用，作物對施入的磷肥當(dāng)季利用效率只有5% ～10%，大部分與土壤中的Ca2+，F(xiàn)e2+，F(xiàn)e3+，A13+結(jié)合形成難溶性磷酸鹽。土壤中存在大量具有解磷能力的微生物，能夠?qū)㈦y溶性的磷酸鹽如磷礦粉轉(zhuǎn)化為水溶性磷，提高土壤中的可溶性磷含量，從而改善植物磷素營養(yǎng)，提高作物產(chǎn)量［4-5］。新疆獨(dú)特的氣候條件和土壤類型，造就其土壤微生物資源及解磷微生物也有其特性。因此，從新疆紅棗根際土壤中分離、篩選高效溶磷細(xì)菌，研究高效微生物菌肥，對調(diào)節(jié)土壤磷素的供需矛盾，促進(jìn)新疆紅棗產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。本試驗(yàn)從新疆紅棗主產(chǎn)區(qū)的18個根際土壤樣品篩選解磷細(xì)菌，研究其對無機(jī)磷和有機(jī)磷的降解能力，獲得了20個代表性解磷菌株，并對其進(jìn)行鑒定和分類，為今后研究新疆紅棗專用微生物肥料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原始土樣采自新疆和田、喀什、阿克蘇、庫爾勒和吐魯番等紅棗主產(chǎn)區(qū)的4 a生和8 a生駿棗及灰棗棗園。采樣時，鏟去表土，深挖10～20 cm，將根際土壤連同棗樹根一同裝入無菌袋，編號。

1.2 培養(yǎng)基的配制

細(xì)菌分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 18.0 g，pH值為 7.0 ～7.2，蒸餾水 1 000 mL。

磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基(Ca3(PO4)2):葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO41.0 g，Ca3(PO4)25.0 g，Agar 15.0 ～ 18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為 7.0～7.5。該培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，不加瓊脂。

蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基(PVK):葡萄糖10.0 g，(NH4)2SO40.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.03 g，MnSO41.0 g，CaCO35.0 g，卵磷脂 2 g，Agar 15.0 ～18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為 7.0～7.5。該培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)基中，不加瓊脂。

1.3 解磷細(xì)菌的分離及篩選

1.3.1 分離 無菌條件下取棗根及黏附其上的根際土壤稱量后，溶于裝有90 mL無菌水的三角瓶中配成10-1稀釋液，28℃，170 r·min-1，振蕩 30 min，使微生物充分的分散。取1 mL稀釋液加入到9 mL無菌水中混勻配成10-2的稀釋液，然后將10-2的稀釋液取1 mL加入9 mL的無菌水中混勻，即為10-3的稀釋液，以此類推，制備 10-4，10-5，10-6等的一系列稀釋液。

用移液器吸取100 μL樣品稀釋液，將稀釋液分別涂布于無機(jī)磷培養(yǎng)基和卵磷脂培養(yǎng)基上，解有機(jī)磷細(xì)菌在28℃ 培養(yǎng) 3 d，解無機(jī)磷細(xì)菌培養(yǎng)7 d，分別記錄具有混濁圈和透明圈的菌落個數(shù)，并挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

純化培養(yǎng)時，將有代表性的單菌落分別接種到牛肉膏蛋白胨斜面上及其液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～2 d，斜面培養(yǎng)物在4℃保存，液體培養(yǎng)物加甘油(終體積分?jǐn)?shù)為20%)，保存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 平板初篩 取分離出的代表性菌株活化24 h后制成菌懸液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用打孔器在卵磷脂平板和磷灰石平板上打孔，每板3個，每孔接種30 μL，重復(fù)3個平板，28℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無溶磷圈，并根據(jù)在平板上形成的混濁圈(或透明圈)直徑，比較其解磷能力的大小［6］。

1.3.3 搖瓶復(fù)篩 取代表性菌株接種于50 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，于30℃，170 r·min-1培養(yǎng)24 h;取2 mL菌液分別接種于滅菌的磷酸三鈣無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，3 次重復(fù)，30 ℃，170 r·min-1培養(yǎng) 6 d，測定有效磷的含量和 pH［7］。數(shù)據(jù)使用 DPS軟件進(jìn)行LSD法多重比較。

1.4 16S rDNA序列測定與系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 16S rDNA的 PCR擴(kuò)增反應(yīng) 根據(jù)細(xì)菌16S rDNA的保守序列，合成一對細(xì)菌特異性引物(通用引物):27 F(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)和 1492 R(5’-GGTTACCTTACGACTT-3’)。PCR 反 應(yīng) 體 系 為 50 μL:5 μL 10 × buffer;1.0 μL 10 mmol·L-1dNTPs;10 mmol·L-1引物27 F 和1492 R 各1 μL;2.0 μL 細(xì)菌基因組 DNA;2U TaqDNA聚合酶。PCR擴(kuò)增條件:94℃，3 min;94 ℃，1 min;52℃，1 min;72 ℃1 min，30 個循環(huán);72℃，10 min，PCR反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物，在1% 瓊脂糖凝膠中電泳，分析PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果［8］。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast分析比對，鑒定其種屬，并上傳所得序列。

1.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 采用 CLUSTALX 1.83軟件進(jìn)行序列比對，用MEGA 5.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩

采用磷酸三鈣無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基分離和田、喀什、阿克蘇、庫爾勒和吐魯番等地區(qū)18個根際土樣品的解磷細(xì)菌，共計(jì)獲得176個菌株，其中從磷酸三鈣無機(jī)磷培養(yǎng)基分離得到79個，從蒙金娜有機(jī)磷培養(yǎng)基分離得到97個。

將分離得到的菌株純化培養(yǎng)后接種到磷灰石板和卵黃板上，培養(yǎng)24 h后，有63個菌株產(chǎn)生了明顯的溶磷圈，有76個菌株溶磷圈不夠明顯，剩下的菌株則沒有發(fā)現(xiàn)溶磷圈。從63個菌株中又進(jìn)一步驗(yàn)證初篩出了解磷能力穩(wěn)定的20個代表性菌株，結(jié)果如表1所示。

表1 表1不同解磷菌株在固體Ca3(PO4)2和PVK培養(yǎng)基上的溶磷情況Table 1 The clear halos of different PSMs on Ca3(PO4)2and PVK agar medium

由表1可知，初篩出的菌株，有17個在以磷酸三鈣為磷源的磷灰石板上形成透明圈，15個在以卵磷脂為磷源的卵黃板上形成混著圈，這些菌株具有解磷能力，可以溶解菌落周圍的磷酸三鈣或卵磷脂，且解磷能力越大，透明圈或混著圈越大，有7個菌株解無機(jī)磷能力較強(qiáng)，D/d ＞2，其中 P12，P16，P193個菌株D/d＞3;有13個菌株解有磷能力較強(qiáng)，D/d＞2，其中 P2，P42個菌株 D/d＞3;還有一些菌株能夠解有機(jī)磷和無機(jī)磷，如 P3，P4，P11，P19等，只是能力強(qiáng)弱不同。

2.2 復(fù)篩

將初篩選出的 20個菌株于 30℃，170 r·min-1培養(yǎng)24 h，分別取2 mL菌液接種于滅菌的磷酸三鈣無機(jī)磷和蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，3次重復(fù)，30℃，170 r·min-1培養(yǎng)6 d，測定有效磷的含量和pH值。

將20個解磷菌株對磷酸三鈣的解磷量和培養(yǎng)液的pH值進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。初篩出來的20個菌株對磷酸三鈣均有不同程度的降解能力，其中P7，P13的能力最強(qiáng)，解磷量達(dá)到300 mg·L-1以上，P6的解磷能力也較強(qiáng)，但穩(wěn)定性相對較差［解磷量為(159.35 ±94.50)mg·L-1］。同時，培養(yǎng)6 d后，培養(yǎng)液的pH值呈下降的趨勢，pH值下降了0.45～1.79。將解磷量與培養(yǎng)液pH值進(jìn)行相關(guān)性分析，得出菌株解磷量與培養(yǎng)液pH值的相關(guān)系數(shù) r=-0.84，P ＜0.01，達(dá)到極顯著水平，回歸分析后得出，Y=815.183-122.005 4 X。

將20個解磷菌株對蒙金娜培養(yǎng)基中卵磷脂的解磷量和培養(yǎng)液pH值進(jìn)行分析，從表2中可以看出，僅有少數(shù)幾個菌株對卵磷脂有較強(qiáng)的解磷能力，P3，P7，P9與對照間差異顯著，P9菌株穩(wěn)定性較弱，P4，P6，P8，P16，P19也有一定的解磷能力，但與對照間無顯著性差異，培養(yǎng)液的pH值維持在一個較高水平，與對照相比，pH值最大下降了1.17，有8個培養(yǎng)液的pH與對照無顯著性差異。將數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析后r=-0.61，P＜0.01達(dá)到顯著水平，回歸分析后得出 Y=7.453-0.067 8 X。

通過以上分析得出，P7，P13的解無機(jī)磷能力最強(qiáng)，P7，P3解有機(jī)磷能力最強(qiáng)，P7能同時降解無機(jī)磷和有機(jī)磷，效果最佳。

表2 解磷菌株培養(yǎng)6 d后對Ca3(PO4)2和PVK的解磷量及培養(yǎng)后培養(yǎng)液的pHTable 2 Amounts of phosphorus dissolved from Ca3(PO4)2and PVK after liquid cultivation for 6 days and the resulting pH values of media

表3 棗解磷細(xì)菌16 S rDNA序列的Blast檢索結(jié)果Table 3 Blastn search results for the 16 S rDNAs of different phosphate-solubilizing bacteria

2.3 16 S rDNA測序和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以20個代表性菌株的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物測序結(jié)果拼接后，與GeneBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行比對，結(jié)果如表3所示:

由表3可知，篩選出的20個菌株主要是Bacillus sp.，Acinetobacter sp.、Pseudomonas sp.、Enterobacter sp.等4個屬的細(xì)菌，同源性達(dá)到99%，以上屬的菌株都有過報(bào)道［9-11］。

采用CLUSTALX 1.83軟件進(jìn)行序列比對，用MEGA5.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1所示，測序的20個菌株序列可以分為4大類，其中 P5，P8，P11，P12，P13，P15為 1 類，與 Acinetobacter sp.(C25JX177 713.1)和 Acinetobacter sp.S3.(MAC.013HM063 913.1)等相似度最高;P4，P6，P7，P20為一類，屬于 Bacillus sp.，其中 P7與 Bacillus sp.WP09-2(KF719 307.1)等相似性達(dá)99%;P2，P16，P18，P19為 1 類，與 Enterobacter sp.VITNC1(JQ398 852.1)等相似性最高，達(dá)99%以上;P9，P10，P14，P17等為1 類，屬于 Pseudomonas sp，與 Pseudomonas sp.5 060(KC236 637.1)等相似性達(dá)99%，P1與Rhizobium sp.XGL136(JQ041 733.1)相似性達(dá)99%，P3與Bacillus subtilis strain F111(HQ647 257.1)相似性達(dá)99%。

3 討論

本試驗(yàn)分離篩選出了具有代表性的20個解磷細(xì)菌菌株，主要 4大類，分別是Bacillus sp.，Acinetobacter sp.，Pseudomonas sp.，Enterobacter sp.等。RODRIGUEZ等人［12］研究認(rèn)為，根際土壤分離的Bacillus sp.和Pseudomonas sp.有較強(qiáng)的解無機(jī)磷能力，本試驗(yàn)中解無機(jī)磷能力最強(qiáng)的P7屬于Bacillus sp.，P13屬于 Acinetobacter sp.。解無機(jī)磷菌株在培養(yǎng)過程中pH值均有不同程度降低，可能是由于釋放了有機(jī)酸或者NH+4使培養(yǎng)液中酸度升高造成的。MOLLA等［13］也發(fā)現(xiàn)有機(jī)磷細(xì)菌有多種 ，包括 Bacillus sp.，Pseudomonas sp.，Micrococcaceae-Pribram，Serratia，Proteus等。試驗(yàn)中，解有機(jī)磷較強(qiáng)的菌株P(guān)3屬于Bacillus subtilisstrain F111，P7屬于Bacillus sp.，P9屬于 Pseudomonas sp.，可見解無機(jī)磷和有機(jī)磷細(xì)菌之間沒有明顯的界限，解磷細(xì)菌在蒙金娜培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)液的pH值總體上沒有明顯的下降，解磷能力較強(qiáng)的菌株P(guān)7，P9的pH值相對較低，然而P3的pH值與對照相差不大，研究認(rèn)為微生物降解有機(jī)磷主要是通過土壤微生物分泌的酸性或堿性磷酸酶，將植酸鹽、磷脂等有機(jī)磷化物水解，轉(zhuǎn)化為簡單的無機(jī)化合物為植物所吸收利用［14］。本研究認(rèn)為有些解磷細(xì)菌的解磷能力不穩(wěn)定，在復(fù)篩過程中，在解無機(jī)磷培養(yǎng)液中P6，P13，P20的磷含量波動較大，如P6在解無機(jī)磷過程中的解磷量為(159.35 ± 94.50)mg·L-1，3 次數(shù)值之間的差異較大;在解有機(jī)磷培養(yǎng)液中P3，P7，P9的磷含量的變化情況也是如此，如P9在解有機(jī)磷過程中解磷量(7.81 ±9.88)mg·L-1。

圖1 棗解磷細(xì)菌的16S rDNA序列為基礎(chǔ)的發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationship of jujube phosphate-solubilizing bacteria and related strain based on 16 S rDNA sequence

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