裂片石莼多糖微波輔助提取工藝優(yōu)化及其卷煙保潤應(yīng)用

楊 君，黃芳芳，秦敏樸，邵 平，孫培龍

(1.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，浙江杭州310008;2.浙江工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，浙江杭州310014)

石莼(Ulva fasciata)又名海白萊、海萵苣，屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、石莼屬，常見種類主要有孔石莼、石莼、裂片石莼等，廣泛分布于西太平洋沿海地區(qū)，浙江沿海石莼資源豐富，是中國野生海藻類中極為豐富的一種資源［1］。近年來，隨著海洋生物的開發(fā)利用，海藻的生物活性及藥用價值被逐漸研究與發(fā)現(xiàn)，其中對海藻多糖的研究最為突出。海藻多糖是藻體主要成分，約占其干質(zhì)量的20% ～70%。研究表明，海藻多糖具有降血脂［2］、調(diào)節(jié)免疫［3］、抗腫瘤［4］、抗病毒［5］等多種生理活性，還有作為藥物或藥物中間體的潛能［6］，在食品、有機肥料、化妝品等領(lǐng)域，體現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和極高的經(jīng)濟價值［7］。

微波輔助提取是微波和傳統(tǒng)水提法相結(jié)合的一種有效的提取方法。它可以促進細胞壁和細胞膜破碎，有利于細胞內(nèi)物質(zhì)的滲出，能有效縮短提取時間及提高多糖的提取率，同時具有設(shè)備簡單、適用范圍廣、污染小等特點［8-9］。楊俊紅等［10］對比了中草藥中有效成分的不同提取方法，MINOO等［11］用微波輔提法(MAE)從茜草科植物中提取茜草素和紫紅素，結(jié)果均表明:MAE效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的提取方法。卷煙的干燥感問題一直制約中式卷煙的發(fā)展，需要在煙草中加入保潤劑。海藻多糖中含有大量的羥基，能與水分子形成化學(xué)鍵，具有一定的吸濕作用。

目前對裂片石莼多糖方面的研究報道不多，本研究以裂片石莼為原料，以多糖提取率為指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)曲面法優(yōu)化裂片石莼多糖微波輔助提取的工藝條件，并研究其吸濕保濕性能，制備樣品卷煙進行綜合感官評吸，從而為海洋海藻資源的綜合開發(fā)和利用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

1.1.1.1 裂片石莼:采自浙江溫州平陽縣南麂列島，經(jīng)過淡水反復(fù)沖洗，陰干，放入60℃烘箱中烘干并粉碎，干燥保存?zhèn)溆?。煙絲:由浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑 質(zhì)量分數(shù)6%苯酚、濃硫酸(分析純)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、蒸餾水、結(jié)晶苯酚、NaOH溶液、氯仿、正丁醇，樣品試劑均為分析純。

1.2 設(shè)備與儀器

靈巧型粉碎機，DJ-04型，上海淀久儀器公司;微波萃取儀，上海新儀微波化學(xué)科技有限公司;電子天平，PL602型，梅特勒—托利多儀器有限公司;紫外—可見分光光度計，752型，上海光學(xué)儀器有限公司;冷凍離心機，HITACHI CR21GII型，日本日立公司;冷凍干燥機，ALPHA 2-4LD PLUS型，德國Marin Christ公司;恒速攪拌器，S-212型，上海申勝生物技術(shù)有限公司;磁力攪拌器，85-1型，杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司;三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器，KQ-300GVDV型，昆山市超聲儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，RE-2000A，上海亞榮生化儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2型，榮華儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖提取工藝流程 取適量裂片石莼粉末，按一定料液比加入蒸餾水，按照設(shè)定的參數(shù)進行微波輔助提取。提取完成后冷卻靜置1 h，然后以 10 000 r·min-1、4 ℃ 冷凍離心 10 min，得上清液和沉淀。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當(dāng)濃度，加入體積分數(shù)95%乙醇溶液，使樣品最終乙醇體積分數(shù)為80%，放置過夜，離心得沉淀，加入少量蒸餾水使沉淀溶解，并將殘留的少量酒精完全蒸發(fā)，冷凍干燥得裂片石莼粗多糖。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取烘干至恒重的葡萄糖0.500 0 g，加水溶解后，定容至100 mL，再取出溶液1 mL到50 mL容量瓶中，加蒸餾水定容。分別吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于試管中，各以蒸餾水補足至2 mL，然后加入1.0 mL質(zhì)量分數(shù)6%苯酚及5.0 mL濃硫酸，振蕩混勻后，置沸水浴中加熱15 min，取出置冰水中迅速冷卻后于490 nm測吸光度，以2.0 mL水按同樣顯色操作作為空白。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，光密度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程 Y=0.5741X+0.0393，R2=0.998 7.

樣品液中多糖含量的測定方法同上(2 mL樣品液替代2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液)。

多糖的測定采用苯酚-硫酸法［12］。

1.3.3 粗多糖得率計算公式 多糖提取率=(m1×D×V/m2)×100%

式中:m1為樣品液OD值對照標(biāo)準(zhǔn)曲線所得糖質(zhì)量;D為稀釋倍數(shù);V為樣品液總體積(mL);m2為原料的質(zhì)量。

1.3.4 單因素分析 分別以微波功率、料液比、提取時間為單因素進行試驗，探討其對裂片石莼多糖提取率的影響。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化裂片石莼多糖微波提取 在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理［12］，選擇微波功率、料液比、提取時間進行三因素三水平的中心組合試驗，利用Design-Expert 7.0軟件進行響應(yīng)面分析，得到17組試驗，確定微波法提取裂片石莼多糖的最佳工藝條件。因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.6 驗證試驗 在最佳提取工藝條件下，進行5次裂片石莼多糖的提取，測定提取率，并驗證其結(jié)果與Design-Expert軟件優(yōu)化出來的多糖提取率的擬合情況。

1.3.7 裂片石莼多糖保潤性能測定 樣品前處理:將卷煙煙絲在溫度(22±1)℃，相對濕度60% ±2%條件下平衡48 h。取120 g平衡后的煙絲，分為2份，其中1份噴灑體積分數(shù)0.1% 裂片石莼多糖提取液，另1份噴灑等量的蒸餾水，然后于溫度(22±1)℃，相對濕度60% ±2% 條件下平衡48 h。

煙絲的吸濕保濕性能測定:將平衡后的煙絲分別置于溫度(22±1)℃、相對濕度40% ±2%和溫度22±1℃、相對濕度80% ±2%的硫酸干燥器中。將每次取出的樣品(煙絲+稱量瓶)進行稱量(精確至0.000 1 g)，前2 d每天取樣2次，之后每天取樣1次，至質(zhì)量恒定。根據(jù)樣品起始含水率和各時間點樣品與起始樣品的質(zhì)量差計算樣品的即時含水率。每組測得的2份數(shù)據(jù)取平均值。即含水率W計算公式如下:

式中:W為試樣的水分質(zhì)量分數(shù)，%;m0為稱量皿質(zhì)量，g;m1為烘干前稱量皿和試料總質(zhì)量，g;m2為烘干后稱量皿和試料總質(zhì)量，g。

初始含水率測定:將上述煙絲烘干至恒重，按照烘箱法測量其含水率，即為初始含水率。

1.3.8 樣品煙感官評定 空白煙絲平衡→添加裂片石莼多糖提取液或蒸餾水→樣品煙絲平衡→打制成卷煙→煙支平衡

空白煙絲平衡:取14 g煙絲在恒溫恒濕箱溫度保持在(22±1)℃，相對濕度保持在60% ±2%)內(nèi)平衡48 h;

多糖溶液的噴灑:取平衡后的煙絲分為2份，其中1份噴灑體積分數(shù)0.1%裂片石莼多糖提取液，另1份噴灑等量的蒸餾水。

樣品煙絲平衡:將添加裂片石莼多糖和蒸餾水的煙絲在溫度(22±1)℃，相對濕度60% ±2%下平衡48 h。

卷煙的打制:用卷煙器手動卷煙，每支卷煙保持在0.7 g煙絲，煙絲分布均與，軟硬適中。

煙支平衡:將制備好的卷煙置于溫度(22±1)℃，相對濕度60% ±2%下平衡48 h。

將制備好含有裂片石莼多糖和蒸餾水的卷煙送往浙江中煙公司，讓專業(yè)評吸人員進行綜合感官評吸，得到評吸結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 微波功率對裂片石莼多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5 g裂片石莼樣品，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水，分別在不同功率 300、400、500、600、700 W下微波處理5 min，然后取出冷卻靜置1 h，以轉(zhuǎn)速10 000 r·min-1、溫度4℃冷凍離心10 min，得上清液和沉淀。取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當(dāng)濃度，加入體積分數(shù)95%乙醇溶液使樣品最終乙醇體積分數(shù)為80%，放置過夜，離心得沉淀，加入少量蒸餾水使沉淀溶解，并將殘留的少量乙醇完全蒸發(fā)，冷凍干燥得裂片石莼粗多糖。所有試驗平行做3組，取平均值。

由圖1可知，不同的微波功率對裂片石莼多糖提取率的影響較為顯著。多糖提取率隨著微波功率的增加顯著提高，這可能是由于微波功率對海藻細胞壁的破壞作用增強，使得多糖從細胞中流出［13］。當(dāng)微波功率達到400 W時，試驗測得多糖提取率最大，為15.83%。而微波功率超過400 W后，多糖提取率呈現(xiàn)明顯下降趨勢，可能是微波對海藻細胞的破壞作用超過極限，從而引起細胞內(nèi)多糖的降解［14］，導(dǎo)致多糖提取率逐漸下降。尤其是當(dāng)微波功率升高到700 W時，多糖提取率明顯下降，僅為9.43%。因此選擇最佳微波功率為400 W。

圖1 微波功率對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave power on polysaccharide extraction rate

2.1.2 提取時間對海藻多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取5 g裂片石莼樣品于三角瓶中，按照料液比1∶20(g∶mL)加入蒸餾水，于微波功率400 W時分別依次萃取5、10、15、20、25 min，然后取出。其后步驟同上。所有試驗平行做3組，取平均值。不同的微波時間對海藻裂片石莼的多糖提取率的影響如圖2所示。

圖2 提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

由圖2可得，不同的提取時間對多糖提取率的影響也較為顯著。隨著提取時間的增加，裂片石莼海藻多糖的提取率顯著提高，在10 min時的效果最佳，提取率達到最大，為14.29%。繼續(xù)增大提取時間，多糖提取率開始下降，尤其是在15～20 min時提取率快速下降。當(dāng)提取時間為20 min時，多糖提取率僅為8.43%，其原因可能是由于微波提取時間過長，輻射能對海藻細胞的作用過度而導(dǎo)致多糖的降解，從而使提取率下降［14］。此外，過長的微波時間作用，也可能會導(dǎo)致雜質(zhì)與目標(biāo)物多糖相結(jié)合，冷凍離心過程中多糖可能隨著雜質(zhì)被一同除去而造成多糖量的損失［15］，使提取率下降。綜合考慮提取率和能耗，選擇最佳提取時間為10 min。

2.2.3 料液比對海藻多糖提取率的影響 準(zhǔn)確稱取一定量的海藻樣品，加入100 mL蒸餾水，使最終料液比分別為1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100(g∶mL)，混勻，在微波功率400 W、提取時間10 min下分別進行萃取，然后取出。其后步驟同上。所有試驗平行做3組，取平均值。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of material solvent ratio on polysaccharide extraction rate

裂片石莼是一種含水率較少的藻類植物，故其多糖提取率可能會受到料液比的影響比較大。由圖3可知，隨著料液比的不斷增大，多糖提取率整體呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)料液比逐漸增大時，多糖提取率先上升(料液比1∶60(g∶mL)，然后急劇下降。而當(dāng)料液比達到1∶100(g∶mL)時，多糖得率反而稍微有所上升，其原因可能是對于一定量的裂片石莼粉末，水溶液的增加可以增加質(zhì)量濃度差以及加大固液接觸的面積，有利于提高溶質(zhì)的擴散速度。但是考慮到后續(xù)工序中有濃縮等加工步驟［16］，加水量過高(即料液比過大)會給試驗帶來不便，使后續(xù)步驟變得繁瑣，所以綜合考慮后，暫定最優(yōu)料液比為 1∶20(g∶mL)。

2.3 裂片石莼多糖提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計與分析

2.3.1 回歸模型的建立與分析 根據(jù) Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，結(jié)合單因素試驗的結(jié)果，選取影響裂片石莼多糖提取率的主要因素，以微波功率(A:300、400、500 W)、提取時間(B:5、10、15 min)和料液比(C:1∶20、1∶30、1∶40(g∶mL))3因素為自變量，多糖提取率Y(%)為響應(yīng)值，設(shè)計了三因素三水平的試驗，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化多糖提取的工藝參數(shù)。

2.3.2 試驗結(jié)果與數(shù)據(jù)分析 本研究的響應(yīng)面試驗結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

根據(jù)單因素試驗確定自變量，分別為微波功率、提取時間和料液比，以裂片石莼多糖提取率為響應(yīng)值，利用Design Expert 7.0軟件對設(shè)計表進行多元回歸擬合，得到裂片石莼多糖提取率(Y)對微波功率(A)、提取時間(B)、料液比(C)的二次多項回歸模型方程:

Y=16.29-0.59A-0.22B-0.57C-0.49AB+0.14AC+0.24BC-2.62A2-0.36B2-1.07C2

表3 微波輔助提取裂片石莼多糖的響應(yīng)面試驗方差分析表Table 3 Analysis results of variance table of microwave-assisted extraction about polysaccharides from Ulva fasciata

從表3可知，對多糖提取率影響明顯的是A、B、C、AB、BC、A2、B2、C2，影響大小依次為微波功率、料液比和提取時間，即微波功率的影響最為顯著，料液比對提取率的影響與微波功率相近，而提取時間最不顯著。

圖4 Y=f(A，B)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.4 Responsive surfaces and contours of Y=f(A，B)

圖5 Y=f(B，C)的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f(B，C)

由上述的回歸分析結(jié)果可知，圖4、圖5分別為(A，B)、(B，C)的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，以研究微波功率(A)、提取時間(B)和料液比(C)等因素對多糖提取率的影響。

圖4中可見，各響應(yīng)面曲線圖能夠較為直觀地反映出各個試驗因素對響應(yīng)值的影響。而對比各因素的等高線圖可發(fā)現(xiàn)，(A，B)及(B，C)則表現(xiàn)有較好的交互作用，即其等高線圖的橢圓程度相對較高。同時該曲線上的最高點，也正是等值線中的面積最小的橢圓中心點，都反映在響應(yīng)面曲面圖和等高線上，即各圖中在響應(yīng)面曲線的最高點和等高線上均存在有“極限值”。對上述圖進行分析可得，微波功率(A)對裂片石莼多糖提取率的影響最為明顯，表現(xiàn)為曲線的傾斜率最大;其次是料液比(C)，該曲線的傾斜率也較大;而提取時間(B)則比較小。

2.3.3 裂片石莼多糖最佳提取條件的確定和驗證試驗 根據(jù)Design Expert 7.0軟件得到的試驗?zāi)Ｐ?，可預(yù)測出在理論條件下的最佳工藝條件:微波功率 391.09 W、提取時間 8.27 min、料液比1∶26.92(g∶mL)，其相應(yīng)的裂片石莼多糖提取率為16.44%。若考慮到實際操作的便利性及可行性，可將最優(yōu)值修正為微波功率400 W、提取時間8 min、料液比 1∶25(g∶mL)。5次多糖提取率為:16.35%、16.29%、16.51%、16.42%、16.26%，平均值為16.37%，與預(yù)測值(16.44%)偏差較小，相對誤差為1.66%，說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面法適用于對微波法提取裂片石莼多糖的工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化。

2.3.4 裂片石莼多糖對煙絲保潤性能的影響 為考察裂片石莼多糖的保潤性能，對添加裂片石莼多糖的煙絲及其空白對照煙絲在溫度(22±1℃)、相對濕度40% ±2%和溫度(22±1℃)、相對濕度80%±2%條件下的解濕和吸濕情況進行了測試。結(jié)果顯示:在低濕條件下(圖6)，空白對照煙絲的含水量下降快于添加裂片石莼多糖的煙絲，在80 h內(nèi)，即時含水率下降較快，之后曲線較為平緩;在高濕條件下(圖7)，空白對照煙絲的含水率增加高于添加裂片石莼多糖的煙絲，在50 h內(nèi)，含水率上升較明顯，之后趨于平緩。綜上所述，裂片石莼多糖具有一定的保潤和防潮功能，在低濕條件下具有相對較慢的解濕速率，而在高濕條件下具有相對較低的吸濕速率。

圖6 煙絲在低濕條件下含水率隨時間的變化Fig.6 The moisture retentivity in low humidity condition in tobacco

圖7 煙絲在高濕條件下含水率隨時間的變化Fig.7 The moisture retentivity in high humidity condition in tobacco

2.3.5 裂片石莼多糖對煙絲的感官評定影響 為考察裂片石莼多糖的保潤性能，對添加裂片石莼多糖的煙絲及其空白對照煙絲，由5位浙江中煙工業(yè)責(zé)任公司煙草專業(yè)資質(zhì)評吸人員進行綜合感官評吸。結(jié)果表明:添加了提取液的煙絲煙氣總體提升，外加物質(zhì)香氣較顯著，透發(fā)性變好，煙氣變細膩，干燥感有改善，對于卷煙感官清爽度、舒適度的提高具有一定作用。刺激性降低，特別是口腔、鼻腔的刺激性，整體下降較為明顯，細膩度、柔和度、圓潤感3指標(biāo)都有上升，因此該組分的多糖添加到煙絲中能較好地改善吸食的口感。

3 討論

利用Design Expert軟件設(shè)計三因素三水平中心組合試驗，采用響應(yīng)面對微波法提取裂片石莼多糖的工藝條件進行了優(yōu)化分析，建立了二次多項式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)檢驗該數(shù)學(xué)模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測裂片石莼多糖的提取率。根據(jù)方差分析和回歸方程的響應(yīng)面及等高線圖可知，微波功率、提取時間、料液比對多糖提取率的影響顯著。多糖的最佳提取工藝條件為:微波功率400 W、提取時間8 min、料液比 1∶25(g∶mL)，此工藝的多糖實際提取率為16.37%，與理論預(yù)測值16.44%相差較小，說明該回歸方程與實際情況擬合較好，充分驗證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)面適用于對微波法提取裂片石莼多糖的工藝進行回歸分析和參數(shù)優(yōu)化;經(jīng)專業(yè)評吸人員對添加裂片石莼多糖的煙絲及其空白對照煙絲進行綜合感官評吸，證明該組分的多糖添加到煙絲中能較好地改善吸食的口感。此外，本試驗還表明裂片石莼多糖能夠在低濕條件下降低煙絲的失水率和失水速率，在高濕條件下有效地減緩煙絲對水分的過量吸收，具有一定的保潤、防潮功能。

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