微載體技術(shù)肝細(xì)胞體外高密度培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)

楊波，劉寶林，任杰，莊靈霞

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093)

急性肝功能衰竭(ALF)病情危重，死亡率高。生物人工肝支持系統(tǒng)(BALSS)可使ALF 患者順利過(guò)渡到肝移植或肝再生，而生物人工肝治療主要依靠大量的肝細(xì)胞，一般需要1010個(gè)功能良好的肝細(xì)胞［1］，因此需求數(shù)量巨大。大量高密度和高活性肝細(xì)胞只能在體外高密度增殖培養(yǎng)。建立一種體外高密度增殖細(xì)胞并能較長(zhǎng)時(shí)間維持細(xì)胞功能的培養(yǎng)方法，對(duì)于生物人工肝的發(fā)展有重要意義。

由于肝細(xì)胞的貼壁依賴性，在高密度條件下，存在細(xì)胞接觸抑制效應(yīng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和表達(dá)會(huì)受到嚴(yán)重影響［2］，因此體外高密度培養(yǎng)肝細(xì)胞需要使用載體材料，以供肝細(xì)胞在其粘附生長(zhǎng)，細(xì)胞在載體材料的粘附是后續(xù)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)，進(jìn)而組織化的關(guān)鍵［3-4］。微載體是目前較廣泛使用的載體材料，其比表面積大，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞高密度培養(yǎng)［5］。國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道了十余種微載體，材料也分為葡聚糖、明膠、玻璃、纖維素、塑料乃至羥基磷灰石等很多類型，用以培養(yǎng)細(xì)胞，取得了良好的效果［6-8］。目前應(yīng)用較多的是美國(guó)GE 公司實(shí)體微載體Cytodex 與多孔微載體Cytopore 等，這些微載體，不只是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以進(jìn)入其空間，細(xì)胞也可以粘附生長(zhǎng)。近年來(lái)，陸續(xù)有Cytodex 與Cytopore 系列載體應(yīng)用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)，并取得滿意的結(jié)果［9-12］。Cytodex 微載體平均直徑為180 μm，可以使200 個(gè)細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)，被廣泛應(yīng)用于貼壁細(xì)胞的生長(zhǎng)，尤其是高密度生產(chǎn)病毒疫苗等;利用較多的是生產(chǎn)CHO 細(xì)胞，CHO 細(xì)胞在微載體Cytodex 的生長(zhǎng)密度和數(shù)量都比在細(xì)胞懸液高很多［13］。大孔微載體Cytopore 能夠?yàn)榧?xì)胞提供貼壁生長(zhǎng)的內(nèi)部空間，細(xì)胞在孔洞里可以高密度生長(zhǎng)，對(duì)貼壁細(xì)胞而言，較大的比表面積和多孔的結(jié)構(gòu)可以提高細(xì)胞產(chǎn)量［14］。

Cytopore 和Cytodex 這兩種微載體，何種更適合于微重力條件下大規(guī)模培養(yǎng)肝細(xì)胞，以達(dá)到高密度并能維持細(xì)胞功能。本課題采用兩種載體進(jìn)行微重力培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)及細(xì)胞活力等情況，并通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝功能中的白蛋白、葡萄糖和尿素等指標(biāo)測(cè)定，探究最佳的微載體濃度和最適宜培養(yǎng)肝細(xì)胞的微載體。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

大鼠肝細(xì)胞;Cytodex 為實(shí)心小球微載體(球徑133 ～215 μm);Cytopore 為大孔微載體(平均粒度235 μm);Me2SO(無(wú)菌);胎牛血清;1640 培養(yǎng)液;葡萄糖等。Sartorius BP 211D 電子天平;HH.CP-01W 二氧化碳培養(yǎng)箱;立式壓力蒸汽滅菌器;ECLIPSE 55i 顯微鏡;LRM340M 酶標(biāo)儀;Quanta FEG 場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡。

1.2 微載體Cytodex 和Cytopore 大鼠肝細(xì)胞的培養(yǎng)

1.2.1 培養(yǎng)板的硅化 超凈臺(tái)上，取一次性無(wú)菌6孔細(xì)胞培養(yǎng)板一個(gè)，在每個(gè)孔中加入60 mL/L 甲基硅樹(shù)脂乙醇溶液12 mL，輕輕搖勻，吸出多余的溶液，置60 ℃電烤箱烘干備用。

1.2.2 微載體Cytodex 和Cytopore 滅菌處理 在超凈臺(tái)上，干燥的微載體在無(wú)Ca2+和Mg2+的磷酸緩沖液(PBS)(每克Cytodex 和Cytopore 各加50 ～100 mL)中在室溫下浸泡膨脹至少3 h。棄去上清液，用新配制的無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS(每克Cytodex和Cytopore 各加30 ～50 mL)洗滌微載體數(shù)分鐘。棄去PBS，換上新的無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS(每克Cytodex 和Cytopore 各加30 ～50 mL)，然后，微載體溶液用高壓滅菌法滅菌(115 ℃，15 min，15 psi)。所有溶液的pH 應(yīng)為7.4。

1.2.3 肝細(xì)胞接種前的平衡 在超凈臺(tái)上，將上述培養(yǎng)板孔中的液體吸出，再用滅菌的無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS 漂洗1 次，吸棄 PBS，用溫和的含有100 mL/L胎牛血清(FBS)及RPMI 1640 培養(yǎng)基漂洗微載體，將溫度調(diào)節(jié)37 ℃，培養(yǎng)基的pH =7. 1 ～7.4，通入95%空氣和5%CO2混合氣體，5 min。

1.2.4 大鼠肝細(xì)胞的接種 在超凈臺(tái)上，將大鼠肝細(xì)胞按2 "105cells/mL 的密度接種于含2 g/L 的Cytodex 或Cytopore (作為三維支架材料，形成三維培養(yǎng)環(huán)境)的六孔培養(yǎng)板中，補(bǔ)充上述培養(yǎng)基至5 mL，置培養(yǎng)板于37 ℃，5%CO2，100%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中。

1.2.5 大鼠肝細(xì)胞與載體的“相對(duì)”靜止培養(yǎng) 前6 h，每15 ～20 min 將培養(yǎng)板取出在超凈臺(tái)上，勻速輕柔水平搖晃1 次，6 h 后每1 h 再搖晃1 次，10 h后每2 h 搖晃1 次，每次搖晃時(shí)間均為1 ～2 min，16 h停止搖晃，置于培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后換液，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色和透亮度來(lái)更換培養(yǎng)液，每次換去約4 mL 的培養(yǎng)上清。

1.3 測(cè)試表征

1.3.1 電鏡的形態(tài)學(xué)觀察 小心用鑷子取0.5 cm3左右的Cytodex 和Cytopore 支架樣本，放入樣品管內(nèi)。噴金，噴鍍均勻后掃描電鏡下觀察。

1.3.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置生物顯微鏡對(duì)培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)行觀察拍照。

1.3.3 細(xì)胞MTT 值的測(cè)定 分別在培養(yǎng)0，2，4，6，8，10 d 時(shí)，使用MTT 試劑盒在酶標(biāo)儀對(duì)細(xì)胞的MTT值進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 肝細(xì)胞的代謝功能 以溴甲酚綠法、二乙酰一肟顯色法、葡萄糖氧化酶法用試劑盒在酶標(biāo)儀測(cè)定白蛋白、尿素和葡萄糖的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

多孔載體Cytopore 的表面積為2.8 m2/g，選取0.5 ～2 mg/mL 4 個(gè)濃度。Cytodex 比表面積小于Cytopore，實(shí)驗(yàn)選取高于Cytopore 的濃度，選用2.0～3.5 mg/mL 4 個(gè)濃度。在細(xì)胞培養(yǎng)的第0，2，4，6，8 d，對(duì)各個(gè)濃度的Cytopore 與Cytodex 進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Cytopore 與Cytodex 濃度與細(xì)胞的密度Fig.1 The relationship between specific productivity and cell density whin Microcarrier concentration Cytopore and Cytodex

由圖1a 可知，1.0 mg/mL 濃度的微載體培養(yǎng)出的細(xì)胞密度值最大，即細(xì)胞生物活性最大、生長(zhǎng)增殖快。所以，本實(shí)驗(yàn)所用的 Cytopore 接種濃度為1.0 mg/mL。

由圖1b 可知，3 mg/mL 的微載體細(xì)胞密度值最大，故選用3 mg/mL 的接種濃度。

2.2 Cytopore 和Cytodex 的掃描電鏡觀察

由圖2 可知，Cytopore 是多孔載體，以纖維素為基架，其內(nèi)部存在大量孔洞，細(xì)胞可以在其內(nèi)部生長(zhǎng)，Cytodex 是實(shí)心球體，以交聯(lián)葡聚糖為基架，外表面化學(xué)偶聯(lián)一層較薄的變性膠原，細(xì)胞可以貼附其表面生長(zhǎng)。

圖2 掃描電鏡下(a)Cytopore 和(b)CytodexFig.2 SEM images of microcarriers(a)Cytopore and (b)Cytodex

2.3 Cytopore 和Cytodex 的顯微鏡觀察

圖3 Cytopore 培養(yǎng)的肝細(xì)胞(×100)Fig.3 Image of cell growth in microcarrier cytopore(×100)(a)培養(yǎng)2 d 后;(b)培養(yǎng)4 d 后;(c)培養(yǎng)6 d 后

圖4 Cytodex 培養(yǎng)的肝細(xì)胞(×100)Fig.4 Image of cell growth in microcarrier cytodex(×100)(a)培養(yǎng)2 d 后;(b)培養(yǎng)4 d 后;(c)培養(yǎng)6 d 后

由圖3 可知，Cytopore 微載體大鼠肝細(xì)胞培養(yǎng)2 d，微載體空洞內(nèi)貼附生長(zhǎng)的細(xì)胞(圖中用箭頭指出)，載體孔隙內(nèi)充滿密集的細(xì)胞，細(xì)胞的直徑一般在10 μm。

由圖4 可知，Cytopore 由于載體特殊的孔洞結(jié)構(gòu)，平均孔徑為235 μm，因此細(xì)胞生長(zhǎng)空間巨大，可以自由生長(zhǎng)聚集，一旦粘附于載體，就可以聚集成團(tuán)生長(zhǎng)，不受空間限制，培養(yǎng)至4 d 開(kāi)始大量貼附于微載體表面，至第6 d 時(shí)細(xì)胞幾乎貼滿微載體表面，生長(zhǎng)至于頂峰，當(dāng)細(xì)胞占滿載體空間后，從第8 d 細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。

2.4 Cytopore、Cytodex 微載體培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的MTT 值及代謝指標(biāo)的對(duì)比

分別在培養(yǎng)0，2，4，6，8，10 d 后對(duì)Cytopore 與Cytodex 培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞BRL 進(jìn)行MTT 值及代謝指標(biāo)的測(cè)定，計(jì)算各值后作出柱狀圖進(jìn)行對(duì)比。

2.4.1 MTT 值 見(jiàn)圖5。

圖5 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞MTT 值比較(珋±s)Fig.5 MTT of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖5 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞所測(cè)的MTT 值在前6 d 均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第6 d 時(shí)其細(xì)胞活性最大，Cytopore 最大達(dá)到0.64，Cytodex 最大達(dá)到0.53，＞6 d 后開(kāi)始明顯下降。Cytopore 微載體培養(yǎng)的細(xì)胞的MTT 值明顯大于Cytodex 培養(yǎng)細(xì)胞的值。

2.4.2 分泌白蛋白量 見(jiàn)圖6。

圖6 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞分泌白蛋白比較(±s，g/L)Fig.6 Albumin concentration of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖6 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞所測(cè)的白蛋白分泌量在前6 d 均呈上升趨勢(shì)，第6 d 時(shí)其細(xì)胞分泌量最大，Cytopore 最大達(dá)到0.95 g/L，Cytodex 最大達(dá)到0.86 g/L，并從第6 d 后開(kāi)始緩慢下降。Cytopore 微載體培養(yǎng)的細(xì)胞的白蛋白分泌量普遍大于Cytodex 培養(yǎng)細(xì)胞的值。

2.4.3 尿素合成量 見(jiàn)圖7。

由圖7 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞的尿素合成量在前6 d 均呈上升趨勢(shì)，并在第6 d時(shí)其細(xì)胞尿素合成量最大，Cytopore 最大達(dá)到6.1 mmol/L，Cytodex 最大達(dá)到2.79 mmol/L，并從第6 d 后開(kāi)始逐漸下降?？傮w來(lái)說(shuō)，Cytopore 微載體培養(yǎng)的細(xì)胞尿素的合成量明顯大于Cytodex 培養(yǎng)細(xì)胞的值，是Cytodex 的1 ～2 倍。

圖7 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞尿素合成量比較±s，mmol/L)Fig.7 Synthesized urea of rat hepatocytes growth in microcarrier

2.4.4 葡萄糖消耗量 見(jiàn)圖8。

圖8 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞葡萄糖含量比較珋±s，μmol/mL)Fig.8 Synthesized urea of rat hepatocytes growth in microcarrier

由圖8 可知，Cytopore、Cytodex 微載體培養(yǎng)的大鼠肝細(xì)胞所消耗的葡萄糖量在前6 d 均呈上升趨勢(shì)，并在第6 d 時(shí)其細(xì)胞葡萄糖含量最大，Cytopore最 大 達(dá) 24. 73 μmol/mL，Cytodex 最 大 達(dá)17.89 μmol/mL，并從第6 d 后開(kāi)始緩慢下降。Cytopore 培養(yǎng)的細(xì)胞消耗的葡萄糖量在培養(yǎng)期間明顯大于Cytodex 培養(yǎng)細(xì)胞的值，是Cytodex 的1 倍。

目前很多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和代謝功能上，微載體培養(yǎng)明顯優(yōu)于靜止培養(yǎng)，是大規(guī)模擴(kuò)增培養(yǎng)細(xì)胞很有前景的技術(shù)手段［15-16］。

3 結(jié)論

以微載體Cytopore 培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞的MTT 值、代謝指標(biāo)值是Cytodex 的1 ～1.5 倍，在細(xì)胞培養(yǎng)期間，以Cytopore 為載體培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)密度比Cytodex 高，細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間多4 d 左右。原因可能是Cytodex 是由葡聚糖構(gòu)成的實(shí)心球體微載體，比表面積為2 700 cm2/g，細(xì)胞鋪滿表面后，就無(wú)法繼續(xù)粘附生長(zhǎng)，阻礙細(xì)胞在培養(yǎng)期間代謝;而Cytopore 為疏松的空心多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，比表面積為1.1 m2/g，其比表面積是Cytodex 的4 倍，大多數(shù)細(xì)胞可以在孔內(nèi)立體生長(zhǎng)，為細(xì)胞的增殖提供了足夠的空間，良好的孔隙有利于細(xì)胞的代謝，更適合大鼠肝細(xì)胞BRL 的培養(yǎng)。但由于它的多孔結(jié)構(gòu)，在顯微鏡下不易觀察到孔洞內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，只能在掃描電鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色處理后才可觀察，無(wú)法實(shí)時(shí)在線觀察。

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