苦皮藤素的提取、鑒定與殺蟲效果實驗研究

黃四平，楊光，王小利，常丹

(咸陽師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽 712000)

苦皮藤素膏是從多年生木本衛(wèi)矛科南蛇藤屬植物中提取出來的植物源殺蟲抑菌劑，是多種β-二氫沉香呋喃多元醇酯類化合物的混合物［1］，是我國具有開發(fā)潛力的一類高效低殘留蔬菜殺蟲抑菌藥［2］。1988 年Wakabayashi 等［3］以苦皮藤為原料，從中分離并鑒定出具有殺蟲活性的苦皮藤素開始，苦皮藤素的提取及工藝、化學(xué)成分分析、結(jié)構(gòu)鑒定及結(jié)構(gòu)修飾、殺蟲機理及殺蟲效果等方面都有了深入研究，特別是西北農(nóng)林科技大學(xué)的吳文君課題組，在這一方面作出了杰出貢獻。在提取方面，吳文君課題組［4-6］采用浸提、層析、重結(jié)晶分離提純了數(shù)十種苦皮藤素化合物，并對其中一些化合物進行了紅外光譜、質(zhì)譜分析。王國亮等［7］以石油醚為提取劑采用索氏提取器常規(guī)法從苦皮藤干種子粉中提取了苦皮藤素，出油率達干重的22.6%。魏亞麗等［8］采用回流法，以苦皮素A 的含量和浸膏量為綜合指標(biāo)，采用正交實驗設(shè)計了實驗，優(yōu)選了實驗提取工藝。在化學(xué)成分分析方面，朱靖博等［9］采用反復(fù)正相硅膠層析與半制備型高效液相色譜結(jié)合方法從苦皮藤中得到3 個化合物，并給出了化合物的1H NMR、13C NMR譜。吳文君等［10］先浸提的方法分離出了苦皮藤素Ⅰ-Ⅶ后，又采用生物活性追蹤方法，從苦皮藤的根皮中分離5 個對粘蟲有毒殺作用的新化合物，并給出了新化合物的紅外光譜、高分辨質(zhì)譜特征。在結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)修飾方面，陳玲等［11］給出了苦皮藤素Ⅲ和苦皮藤素XIX 的1H NMR 和13C NMR 譜特征和DEPT、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC 等二維2D NMR 特征。張繼文等［12］根據(jù)天然殺蟲活性物質(zhì)苦皮藤素V 分子結(jié)構(gòu)含特征，采用常規(guī)方法合成了苦皮藤素V 的酯、酮及醚衍生物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR 確認(rèn)，并采用葉碟飼蟲法，測定了合成衍生物對粘蟲的殺蟲活性。邵嚴(yán)亮［13］等以1β，2β，4α，6α，8β，9α，13-七羥基-β-二氫沉香呋喃為起始原料合成了7 個雙呋喃二氫沉香呋喃醚類衍生物，以室內(nèi)人工累代飼養(yǎng)的3 齡粘蟲幼蟲為試蟲，采用載毒葉片法測定了殺蟲活性。在殺蟲效果及機理方面，祁志軍等［14］采用灌胃法與蓄積毒性試驗法研究了0.2% 苦皮藤素乳油對鵪鶉的急性毒性與蓄積毒性，結(jié)果表明該乳液對鳥類低毒，但在鵪鶉體內(nèi)輕度蓄積。徐河山等［15］證明了苦皮藤根粉中的苦皮藤素V 通過破壞粘蟲幼蟲的腸腸壁細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜對粘蟲、稻苞蟲、棉小造橋蟲、棉大卷葉螟和菜青蟲等幼蟲具有胃毒和麻醉作用。姜自德等［16］研究了1%苦皮藤素乳油對書虱的防治效果表明，施藥后一天就可以達到95%以上的防治效果，且持效期可達10 d 以上。

本文通過回流法從采集于陜西省寧陜縣火地塘林場的苦皮藤中提取了苦皮藤素膏，通過高效液相色譜對其進行了分離與結(jié)構(gòu)鑒定，并研究了其光譜性質(zhì)進行了初步殺蟲實驗。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

丙酮、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、羧甲基纖維素鈉、薄層層析硅膠均為分析純;苦皮藤，陜西省寧陜縣火地塘。

101A-1B 型鼓風(fēng)干燥箱;RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器;BS224 S 型精密電子天平;800 型離心機;IRPrestige-21 型傅里葉變換紅外光譜儀;DK-98-1 型紫外可見分光光度計;2W 阿貝折光儀;LC-10AT 高效液相色譜儀。

1.2 實驗過程

1.2.1 實驗提取過程 準(zhǔn)確稱取苦皮藤根皮粉末30 g，經(jīng)過回流裝置回流，以甲醇為溶劑，提取溫度為50 ℃，苦皮藤粉與提取液的比為1∶6，選擇回流次數(shù)為3 次，每次提取的時間為2 h，即向回流裝置中加入160 mL 的甲醇，進行回流2 h，對回流液進行收集，再次用160 mL 溶劑過2 h，對回流液進行收集，再次分別用提取溶劑提取2 h，對回流液進行收集，合并3 次濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器處理收集的溶液。

1.2.2 實驗檢測過程

1.2.2.1 折光率測定 利用阿貝折光儀對提取物進行折光率的測定，實驗對甲醇溶解的不同濃度的提取物溶液的折光率的測定，同一濃度的溶液檢測3 次，求其平均值。

1.2.2.2 紫外分光光度計的檢測 取少量苦皮藤提取物，用甲醇溶解為0.002 g/mL，通過紫外分光光度計進行檢測。

1.2.2.3 紅外光譜測定 將提取物用甲醇溶解，滴至溴化鉀薄片上，再用溴化鉀薄片蓋壓，經(jīng)傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀檢測。

1.2.2.4 高效液相色譜測定 經(jīng)提純后的1%苦皮藤素浸膏1 mL，用甲醇超聲溶解定容至100 mL后，用0.4 μm 有機膜過濾，用HPLC 測含量。

色譜條件:色譜柱的柱長及直徑250 mm ×4.6 mm，0.45 μm 用色譜純甲醇和用水膜過濾的蒸餾水，體積比為8∶2;流速為1.0 mL/min;檢測波長為230 nm;柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL。

“一帶一路”背景下城鎮(zhèn)化與農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化的協(xié)調(diào)發(fā)展——以河西走廊地區(qū)為例……………………………葉 超 祝佳佳（21）

1.2.2.5 殺蟲效果初步實驗 胃毒活性測定采用葉片載毒飼蟲法［17］:將樣品溶液用丙酮稀釋成20 mg/mL的溶液，然后點2 μL 在0.25 cm2的卷心菜葉片上，使丙酮揮發(fā)掉。將饑餓8 h 的蟋蟀試蟲分頭放在培養(yǎng)皿里，用點過樣品的葉片喂養(yǎng)。24 h后，查看其死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 折光率測定結(jié)果

苦皮藤素折光率測定見表1。

表1 苦皮藤素折光率測定Table 1 The refractive index of the Celangulin cream

由表1 可知，苦皮藤素的濃度不同，折光率有所不同;濃度越低，折光率越低。其折光率范圍在1.32～1.33。說明苦皮藤浸膏是由多種純苦皮藤素的混合而成。

2.2 紫外光譜測試結(jié)果

苦皮藤素浸膏紫外光譜見圖1。

圖1 苦皮藤素浸膏紫外光譜Fig.1 UV of the Celangulin cream

通過紫外光譜圖可知，該苦皮藤浸膏在256 nm有吸收峰，且吸收強度為弱吸收，為苯環(huán)類的b 帶吸收。說明苦皮藤素中有苯環(huán)存在。

2.3 紅外光譜測定結(jié)果

由紅外光譜可明顯觀測到，在波數(shù) υmax3 544 cm－1到3 430 cm－1的寬峰，結(jié)合1 300 ～1 500 cm－1附近是有氫鍵締合的O—H 變角振動峰，說明為苦皮藤素中自由羥基O—H 伸縮振動特征吸收峰;在波數(shù)υmax為1 680 cm－1附近出現(xiàn)的強吸收峰，為苦皮藤素中酯基—COO—的特征吸收，結(jié)合波數(shù)為1 200 cm－1左右的吸收峰，這正是—COO—的吸收峰。由圖還可以看出，在1 090 ～1 140 cm－1的吸收峰是仲、叔醇類。1 427.80 cm－1附近則是—CH2—的變形伸縮振峰這也正是—CH2—的吸收峰。苦皮藤素為多元醇酯類化合物。

圖2 苦皮藤素浸膏紅外光譜Fig.2 IR of the Celangulin cream

2.4 高效液相色譜測試結(jié)果

圖3 樣品溶液色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample solution

經(jīng)過與標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照，該苦皮藤浸膏中含有3種苦皮藤素成分，且在一定濃度范圍內(nèi)，苦皮藤素的峰面積與質(zhì)量濃度具有線性關(guān)系。根據(jù)參考文獻［2］，浸膏中苦皮素A 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(CA×稀釋倍數(shù)×V濾)/(浸膏質(zhì)量g)

式中 CA——待測品中苦皮素A 的質(zhì)量濃度，mg/mL;

V濾——濾液的體積，mL。

式中 CA——待測品中苦皮素A 的質(zhì)量濃度，mg/mL;

A樣——待測品峰面積;

C標(biāo)——對照品中苦皮素A 的質(zhì)量濃度，mg/mL;

A標(biāo)——對照品峰面積。

原料中苦皮素A 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(CA×稀釋倍數(shù)×V濾)/(原料質(zhì)量g)

經(jīng)計算，苦皮藤素浸膏中苦皮藤素的含量最大可達14.3%。

2.5 殺蟲實驗結(jié)果

結(jié)果表明，苦皮藤素類浸膏對蟋蟀成蟲有明顯的胃毒活性，在上述實驗濃度下，對蟋蟀成蟲的胃毒活性(死亡率)分別為90%以上。

3 結(jié)論

(1)回流法對陜西苦皮藤素有較好的提取效果，經(jīng)分析后，其中的苦皮藤素浸膏中苦皮藤素的含量最大可達14.3%。

(2)殺蟲實驗證明，陜西苦皮藤素浸膏對蟋蟀成蟲有較好的毒殺作用，在24 h 內(nèi)對蟋蟀成蟲的殺滅率達90%以上。

［1］ 李衍方，劉玉玲，宋湛謙.殺蟲植物苦皮藤的研究新進展［J］.農(nóng)藥，2006，45(3):148-151.

［2］ 黃四平，常丹，王小利，等. 浸漬法提取苦皮藤素的工藝條件研究［J］.應(yīng)用化工，2015，44(1):87-91.

［3］ Wakabayashi N，Wu W J，Waters R M，et al.Celangulin:A nonalkaloidal insect antifeedant from chinese bittersweet，celastrus angulatus［J］. Journal of Natural Products，1988，51(3):537-542.

［4］ 劉惠霞，吳文君，王美珍.苦皮藤根皮的紅外光譜特征及其在鑒別中的應(yīng)用［J］. 西北植物學(xué)報，1998，18

(2):305-310.

［5］ 張繼文，吳文君，田暄.苦皮藤素類似物的合成與結(jié)構(gòu)鑒定［J］.農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2004，6(3):21-25.

［6］ 吳文君，胡兆農(nóng)，劉惠霞，等. 苦皮藤主要殺蟲有效成分的殺蟲作用機理及其應(yīng)用［J］. 昆蟲學(xué)報，2005，48

(5):770-777.

［7］ 王國亮，南蓬，龔復(fù)俊，等. 昆蟲拒食劑新資源——苦皮藤果油的化學(xué)成分研究初報［J］.武漢植物學(xué)研究，

1989，7(3):301-302.

［8］ 魏亞麗，吳鳴建，趙天增.植物源殺蟲劑苦皮藤素的提取新工藝研究［J］.河南科學(xué)，2008，26(1):31-34.

［9］ 朱靖博，孫曉昱，慕巖峰.苦皮藤B-二氫沉香呋喃多元醇酯類化合物分離及結(jié)構(gòu)解析［J］. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2009，28(3):169-173.

［10］吳文君，王明安，朱靖博，等. 殺蟲植物苦皮藤毒殺成分的研究［J］.有機化學(xué)，2002，22(9):631-637.

［11］陳玲，張海艷，趙天增，等.苦皮藤素Ⅲ和苦皮藤素XIX的NMR 數(shù) 據(jù) 解 析［J］. 河 南 科 學(xué)，2010，28 (8):925-930.

［12］張繼文，姬志勤，吳文君.苦皮藤素V 的結(jié)構(gòu)修飾及生物活性［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2004，32(10):99-102.

［13］邵嚴(yán)亮，張繼文，吳文君.二氫沉香呋喃醚類衍生物的合成及其殺蟲活性［J］. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2007，9(1):14-18.

［14］祁志軍，吳文君.0.2%苦皮藤素乳油對鵪鶉的毒性測試［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2000，9(4):75-77.

［15］徐河山，馬雅軍. 植物源殺蟲劑作用方式和機理的研究進展［J］.熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，6(6):743-745.

［16］ 姜自德，張宏宇，侯善社. 苦皮藤素防治書虱的研究［J］. 糧油倉儲科技通訊，2011(6):52-53.

［17］吳文君.植物化學(xué)保護實驗技術(shù)導(dǎo)論［M］.西安:陜西科技出版社，1987:85-87.