3D 打印技術(shù)及在組織工程領(lǐng)域的研究進展

田冶 曾慶慧 胡相華 任雅清 何曉帆

1 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣州 510663）

2 廣州市生物醫(yī)用血液凈化材料研究與開發(fā)重點實驗室 （廣州 510663）

3 暨南大學材料科學與工程系 （廣州 510632）

生物支架是組織工程研究的重要組成部分，是一種能夠模仿天然組織功能，適合種子細胞生長和發(fā)揮生物學功能的生物活性材料，是影響組織重建成功與否的關(guān)鍵因素之一[1]。作為種子細胞的生物學載體，理想的支架需具有良好的生物相容性、生物可降解性和適宜的力學強度等生物理化性質(zhì)[2]。通過材料的選擇、配比以及相應(yīng)的改性處理，可較為容易地實現(xiàn)對該性能的控制[3～5]。但需注意的是，支架的設(shè)計最終是以臨床應(yīng)用為目的的。對于不同的患者及不同的缺損組織部位，其外形和微觀結(jié)構(gòu)必然存在差異。而以凍干法、靜電紡絲法、超臨界法等為代表的傳統(tǒng)的組織工程支架制備方法[6,7]，難以制備這種在結(jié)構(gòu)特點上存在差異的個性化特性明顯的支架。

3D 打印技術(shù)的出現(xiàn)為解決這一問題提供了新的途徑。利用3D 打印技術(shù)，可根據(jù)患者缺損 /病變部位的成像數(shù)據(jù)，快速、精確的制造個性化組織工程支架。該技術(shù)不僅能夠?qū)崿F(xiàn)支架與患者缺損/病變部位的完美匹配，能夠在形態(tài)上模仿天然組織的微觀結(jié)構(gòu)，甚至能攜帶細胞與材料一起打印，通過控制細胞的排列促進細胞在支架上的生長與分化以獲得理想的組織修復效果。因此，3D 打印技術(shù)在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用獲得了越來越廣泛的關(guān)注并取得了顯著的研究成果[8～10]。本文主要介紹3D 打印技術(shù)的原理和打印方式并綜述近年來3D 打印技術(shù)在制備組織工程支架方面的研究進展以及目前存在的問題和未來發(fā)展方向。

1.3D打印的基本原理

圖1. 3D 支架的CAD 設(shè)計圖和打印支架。a）外部結(jié)構(gòu)；b）內(nèi)部結(jié)構(gòu)；c）打印支架[12]

3D 打印是20 世紀80 年代末興起的一門新技術(shù)，其打印原理簡單來說是采用分層加工、迭加成型的技術(shù)，即通過逐層增加材料來形成3D 實體[11]。3D 打印原理和打印方式與普通噴墨打印機十分相似，最大的不同在于：3D 打印機的噴頭不僅能在平面上移動，還能夠垂直移動。對于組織/器官的3D 打印，其基本步驟是：首先獲取患者病變/缺損組織的斷層掃描（CT）、磁共振成像（MRI）數(shù)據(jù)，利用計算機輔助設(shè)計(CAD)建立圖像模型(圖1)，根據(jù)各種參數(shù)將掃描圖像按一定的厚度進行虛擬“切片”，然后將相關(guān)數(shù)據(jù)輸送到3D 打印機中，打印機按照這些極薄的“切片”，用合適的生物材料逐層打印并堆積起來，最終形成與組織一致的三維支架[13]。3D 打印的最大優(yōu)點在于其能夠精確、快速實現(xiàn)支架復雜的宏觀外形與內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的一體化構(gòu)建，可以實現(xiàn)針對特定患者、特定組織器官的個性化生產(chǎn)，這是其他的傳統(tǒng)支架成型方法所不可企及的[14]。

2.3D打印技術(shù)及適用材料

目前，應(yīng)用較多的3D 打印技術(shù)包括光固化立體印刷（Stereolithography, SLA），熔融沉積成型（Fused Deposition Modeling， FDM）、選擇性激光燒結(jié)（Selective Laser Sintering，SLS）和材料-細胞同時打印的3D 生物打印等[15, 16]。每種打印技術(shù)均有其優(yōu)缺點和適用的材料。

2.1 光固化立體印刷[17～19]

SLA 是最早，也是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的3D 打印技術(shù)。SLA 主要使用的原料為光敏性樹脂，包括光敏分子修飾的高分子，如聚乳酸(PLA)、聚己內(nèi)酯（PCL）以及蛋白質(zhì)和多糖等，也可加入其他材料形成復合材料[20,21]。它是通過紫外激光束在光敏樹脂表面進行逐層掃描，被掃描區(qū)域的樹脂層發(fā)生光聚合反應(yīng)而固化形成一個薄層，一層固化完畢后，工作臺下降一個凝膠層厚度，在固化好的樹脂表面再覆蓋上一層新的液態(tài)樹脂，然后進行下一層的掃描加工，新固化層牢固黏在前一層上，經(jīng)過逐層掃描固化，最終獲得三維支架。光固化立體印刷技術(shù)具有高精度、性能穩(wěn)定、支架力學強度高等優(yōu)點，但其缺點是成型后需要清洗除去雜質(zhì)，且僅適用于具有光敏性的高分子材料。

2.2 熔融沉積成型[22～24]

FDM 是通過熱熔噴頭將熔融態(tài)的材料按計算機控制路徑擠出、沉積并凝固成型，經(jīng)過逐層沉積、凝固得到所需的三維產(chǎn)品。FDM 所使用的原料通常為熱塑性高分子，包括聚酰胺、聚酯、聚乙烯等。該技術(shù)的優(yōu)點是成型精度高，支架強度好，因為其沒有使用溶劑或其他添加劑，所以成型無需后續(xù)的除雜質(zhì)步驟；其缺點是打印溫度較高，易造成高分子材料的降解且會對生物大分子的活性造成影響。

2.3 選擇性激光燒結(jié)[25～27]

SLS 是利用激光束將粉末狀的原料表面熔融、粘結(jié)固化，經(jīng)過逐層掃描、熔融、粘結(jié)、固化后獲得三維材料。與SLA 通過紫外光粘結(jié)固化不同，SLS 是通過激光產(chǎn)生高溫使粉末狀原料表面熔融實現(xiàn)粘合，因此，其適用的原料更為廣泛，除了高分子材料，無機非金屬、金屬粉末等也可用作打印材料。但相比于SLA，其打印產(chǎn)品的表面較粗糙，并且激光的高溫作用也會造成高分子材料的降解。

2.4 與細胞結(jié)合的3D 生物打印[28～30]

以上幾種打印方式，均是單獨采用材料作為打印原料，支架成型后再引入細胞構(gòu)建細胞-支架復合物。但采用這種方式往往存在支架內(nèi)生長的細胞密度較低且分布不均，細胞在支架表面生長良好，而在支架內(nèi)部尤其是在支架的中心區(qū)域極少細胞能夠進入的問題。3D 生物打印技術(shù)則以活體細胞、營養(yǎng)物質(zhì)和液態(tài)生物材料的共混物作為打印“墨水”，直接打印材料-細胞的一體化支架，是目前3D 打印技術(shù)中最引人關(guān)注的一種打印方式。與以上打印技術(shù)相比，3D 生物打印的一體化支架可以獲得更高且分布均勻的細胞密度，可以在微觀尺度上控制細胞的排列分布，這對于調(diào)節(jié)細胞行為、細胞間和細胞與材料間的相互作用，以及促進細胞最終形成功能組織具有十分重要的意義。需注意的是，由于細胞對生存環(huán)境的要求十分苛刻，因此適用于3D 生物打印的生物材料極為有限。目前使用較為廣泛的是各類可聚合的水凝膠材料，如將雙鍵封端的聚乙二醇（PEG）水溶液與含有細胞的培養(yǎng)液混合形成可光聚合的材料-細胞混合液作為打印原料，制備包含有細胞的水凝膠支架[31]。除光聚合反應(yīng)技術(shù)，其他生物相容的原位凝膠成型技術(shù)也被廣泛應(yīng)用，如將藻酸鹽與細胞混合溶液打印成型后，利用藻酸鹽與鈣離子的交聯(lián)作用形成穩(wěn)定的凝膠支架[32]；利用包含細胞的凝血酶溶液作為墨水，噴入纖維蛋白原溶液基質(zhì)中，通過凝血反應(yīng)凝固成包含有細胞的纖維蛋白支架[33]；利用含細胞的膠原溶液打印后，使其pH 值升高至中性，通過膠原自身的物理凝膠化形成支架等方法[34]。

3.3D打印在組織工程中的應(yīng)用

近年來，研究者對組織工程支架的設(shè)計提出了4F 準則：形狀訴求（Form）、性能訴求（Function）、功能訴求（Formation）和可植入性（Fixation）[35]。形狀訴求是指支架材料必須能夠完全填充復雜的三維缺陷，并且可以誘導組織再生；性能訴求是指支架的力學性能等可以在缺失組織修復前暫時起到缺失組織作用的需求；功能訴求是指材料需具有相應(yīng)的生物活性，能夠為細胞提供適宜的環(huán)境以促進組織再生；可植入性是指支架可通過手術(shù)植入人體，并起到預(yù)期功效。以此為原則，研究者希望利用仿生學等原理，體外構(gòu)建適合組織細胞生長的顯微結(jié)構(gòu)，盡可能地模擬體內(nèi)環(huán)境，從而協(xié)調(diào)不同細胞的增殖、分化、遷移和凋亡等。利用3D 打印技術(shù)制備的個性化支架，能夠精確模擬天然組織復雜的三維微觀結(jié)構(gòu)，支架形狀與缺損組織高度吻合，并能通過支持生長因子、細胞的共同打印賦予支架生物活性，因此在組織工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

3.1 骨組織工程

骨組織是一種由無機納米羥基磷灰石顆粒與膠原及少量非膠原蛋白等基質(zhì)自主裝形成的多孔復合材料。與其他組織相比，骨組織的結(jié)構(gòu)與功能相對較簡單，因此，骨組織工程獲得廣泛關(guān)注并取得飛速發(fā)展[36,37]。研究者希望骨組織工程支架的設(shè)計能盡量模仿天然骨的復雜的多孔微觀結(jié)構(gòu)，因為微環(huán)境不僅會對細胞的增殖分化行為，也會對支架材料的力學性能、滲透性/擴散性造成影響。研究認為，具有較大孔徑的材料能獲得較高的細胞密度，而高滲透性、多孔通道和力學強度的支架能明顯促進成骨細胞的信號表達[38,39]。3D 打印技術(shù)能夠準確控制微孔的分布、空間走向和相互連通等結(jié)構(gòu)特征[40]。Das 等以聚己內(nèi)酯（PCL）為原料制備了可降解支架，其壓縮模量和屈服強度分別為52～67MPa 和2.0～3.2MPa，該強度達到或接近了人松質(zhì)骨的力學性能范圍，并且獲得的支架能與缺損部位的骨組織緊密結(jié)合，具有良好的生物相容性[41]。Inzana 則以磷酸鈣為原料打印支架，并利用膠原對支架進行改性，植入鼠腿骨缺損處9 周后發(fā)現(xiàn)，支架具有骨傳導特性，隨著支架的降解，缺損部位逐漸被新生骨組織填充[42]。為進一步增強打印支架的生物活性，Pati 等首先在PCL/PLGA/β-TCP 復合支架中引入hTMSCs 細胞，培養(yǎng)一段時間后去除細胞，則支架表面被一層細胞外基質(zhì)（ECM）所覆蓋，將其植入小鼠體內(nèi)缺損部位并培養(yǎng)一段時間后發(fā)現(xiàn)，未加支架的缺損部位僅有較薄的一層纖維化組織（圖2c），植入PCL/PLGA/β-TCP 支架的，其缺損部位被一層厚厚的纖維化組織所填充，而植入了覆蓋ECM 的復合支架的缺損部位有大量的類骨組織形成，缺損部位幾乎完全被修復，顯示復合支架具有較好的修復能力[43]。

圖2. 3D 打印骨支架和植入缺損部位后的修復情況。a） PCL/PLGA/β-TCP支架； b）覆蓋ECM 的PCL/PLGA/β-TCP 復合支架；c)未植入支架的缺損部位；d)植入PCL/PLGA/β-TCP 支架的缺損部位；e)植入覆蓋ECM 的PCL/PLGA/β-TCP 復合支架的缺損部位[43]

3.2 軟骨組織工程

由于軟骨組織無血液供應(yīng)和神經(jīng)支配，并且軟骨細胞的低代謝活性以及高密度的細胞外基質(zhì)限制了軟骨細胞向缺損區(qū)域移行，在受損后無法自行修復[44]，因此組織工程在軟骨修復中具有極大的應(yīng)用前景。軟骨基質(zhì)的化學成分主要為嗜堿性軟骨粘蛋白，它以長鏈的透明質(zhì)酸分子為主干，干鏈上以許多較短的蛋白質(zhì)鏈連接硫酸軟骨素A、C 和硫酸角質(zhì)素。這種羽狀分支的大分子結(jié)合著大量的水，大分子又相互結(jié)合，并和膠原原纖維結(jié)合在一起形成凝膠結(jié)構(gòu)。Woodfield 等利用3D打印技術(shù)制成的PEGT/PBT 支架，其模量和剛度分別在0.05～2.50MPa 和0.16～4.33MPa 之間，與天然軟骨組織（模量0.27MPa，剛度4.10MPa）的力學性能相似，植入裸鼠皮下具有明顯的成軟骨作用[45]。Lima 等以聚乙二醇異丁烯酸酯（PEGDMA）/軟骨細胞混合液為墨水，通過紫外光聚合打印軟骨凝膠支架（圖3a，b），細胞通過層層打印聚合方式能夠在凝膠支架內(nèi)均勻分布并保持了較好的細胞活性（圖3c），支架與周圍組織能夠較緊密的結(jié)合，在植入物和天然軟骨組織界面上有大量蛋白多糖沉積并有大量的粘多糖分泌[46]。需注意的是，這種對于軟骨的單一修復仍存在與受損部位結(jié)合不牢固等問題。在正常骨軟骨組織中，軟骨與軟骨下骨通過鈣化層相連，此外鈣化層也將軟骨與軟骨下骨分隔在不同的生存環(huán)境中。由于軟骨缺損時，其下的軟骨下骨常出現(xiàn)硬化、退變，而新生軟骨是無法與病變的軟骨下骨進行整合的，所以在修復軟骨的同時，必須還要重視軟骨下骨的修復。目前的解決方法是采用分層結(jié)構(gòu)材料來促進關(guān)節(jié)軟骨/骨組織的協(xié)同一體化修復[47]。如Teoh 等以 PCL 為原料，利用3D 打印制備了骨軟骨一體化支架，并將成骨細胞與軟骨細胞分別種植于支架的兩部分，2 種細胞在支架中分泌出不同的細胞外基質(zhì)，在成骨細胞種植區(qū)出現(xiàn)了較高的骨鈣分泌，而在軟骨細胞種植區(qū)測得了較高的堿性磷酸酶，該結(jié)果表明這種復合支架可應(yīng)用于骨-軟骨的一體化修復[48]。

3.3 血管組織工程

血管組織具有獨特的三層結(jié)構(gòu)，即內(nèi)壁面是一層內(nèi)皮細胞、中層主要是由彈性纖維組織、膠原和平滑肌組成，最外層包圍著疏松的結(jié)締組織，這種結(jié)構(gòu)決定了天然血管具有良好的抗凝血和彈性。理想的血管支架要求能夠具有或模擬天然血管的三層結(jié)構(gòu)，不易產(chǎn)生血栓，具有血管的粘彈性及能夠承受一定壓力的力學特性等特點。Boland 等應(yīng)用噴墨打印技術(shù)將牛血管內(nèi)皮細胞與藻酸鹽水凝膠同步打印，形成內(nèi)皮細胞-水凝膠三維復合物，發(fā)現(xiàn)黏附于水凝膠支架內(nèi)部的內(nèi)皮細胞存活時間較長并具有良好的細胞活性[49]。MILLER 等首先將碳水化合物玻璃打印成網(wǎng)格狀模板，用澆注法復合載細胞水凝膠形成管道狀血液通路，并證實這些血管通路能夠有效的保持工程化組織中肝細胞的新陳代謝功能[50]。Kolesky等則利用3D 打印構(gòu)建了由多種類型細胞和細胞外基質(zhì)組成的三維支架，支架內(nèi)存在復雜的充滿了內(nèi)皮細胞的血管網(wǎng)絡(luò)（圖4），該支架可以用于藥物篩選模型以及考察傷口愈合和血管形成的基礎(chǔ)性研究[51]。

圖3. 3D 打印PEGDMA/軟骨細胞凝膠復合支架. a，b)復合支架; c）軟骨細胞在層層打印-聚合支架內(nèi)的均勻分布; d）細胞在打印后再聚合支架內(nèi)的不均勻分布[46].

圖4. 3D 打印灌注有內(nèi)皮細胞的血管網(wǎng)絡(luò)[51]

4.3D打印存在的技術(shù)難點及展望

相對于其他組織工程學的體外構(gòu)建技術(shù)，3D打印技術(shù)特別適合復雜結(jié)構(gòu)支架的成型，在制造具有多孔和復雜微觀結(jié)構(gòu)的復合植入物方面具有獨特優(yōu)勢，但同時也存在著不少技術(shù)難題：首先，對于各種3D 打印方式尤其是攜帶細胞的3D 生物打印，理想的“墨水”除了需具有一般生物材料良好的生物相容性和可降解性外，還需具有可打印成型及在成型后支架能保持適宜的力學強度和生物活性等性能，而目前能夠同時滿足這些要求的生物材料的選擇性較少。其次，理想的支架內(nèi)需含有一定密度和功能性的細胞，利用細胞與材料同時打印，需注意“墨水”的粘滯性、密度、表面張力等參數(shù)會影響細胞的生存能力[52]。同時打印前，打印過程中均要求“墨水”為液態(tài)，而打印后又要求其立即凝固，這種由液態(tài)到固態(tài)的變化必須能夠保證不引起細胞、生物活性因子及其他微粒的損失。最后，目前利用3D 打印技術(shù)構(gòu)建的支架，大多只是一個簡單的細胞層疊的堆積體，沒有相應(yīng)的組織功能，如何實現(xiàn)支架內(nèi)細胞間的相互信號傳導以及支架內(nèi)血管的長入，以實現(xiàn)打印器官的最終功能化仍有很長的一段路要走。

盡管如此，3D 打印尤其是與細胞結(jié)合的3D生物打印仍具有其他成型方法無可比擬的優(yōu)勢，這也決定了在今后很長的一段時間內(nèi)將會是組織工程研究的熱點之一。國內(nèi)外不少研究中心及實驗室已經(jīng)利用3D 打印技術(shù)構(gòu)建各種個性化支架，其在骨與軟骨組織工程領(lǐng)域的部分研究成果已進入臨床試驗。相信隨著對支架材料、干細胞技術(shù)以及細胞與微環(huán)境相互作用機制研究的不斷深入和突破，利用3D 打印技術(shù)構(gòu)建個性化并具有功能性的人工器官將不再是遙不可及的目標。

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