通解口服液對(duì)MO D S模型大鼠回腸P P A R-γ、A P-1、N F-κB表達(dá)的影響

沈宇清 賈典榮 曹 云 顧志林

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬姜堰中醫(yī)院，江蘇姜堰225500）

多器官功能障礙綜合征 （multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是目前創(chuàng)傷、感染、休克等疾病最重要的死亡原因，目前醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為胃腸道是MODS發(fā)病過(guò)程中受累較早的器官，胃腸黏膜缺血炎癥反應(yīng)是其重要的病理機(jī)制之一。近年有研究報(bào)道過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR-γ）是調(diào)節(jié)缺血炎癥反應(yīng)的重要作用靶點(diǎn)，而中藥通過(guò)干預(yù)炎癥反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮著胃腸功能的保護(hù)作用。本院研發(fā)的通解口服液具有通里攻下、活血化瘀等作用，臨床發(fā)現(xiàn)其對(duì)MODS患者急性胃腸損傷有防治作用[1]。為進(jìn)一步研究通解口服液防治MODS急性胃腸損傷的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立MODS大鼠模型，觀察通解口服液對(duì)MODS模型大鼠回腸組織PPAR-γ、激活蛋白-1（AP-1）、核轉(zhuǎn)錄因子 κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探索MODS新的防治途徑。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠48只，體重（190±20）g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（浙）2008-0033。

1.2 藥物 通解口服液（處方：大黃、蒲黃、敗醬草、枳實(shí)、茜草各等份，藥物濃度0.85g/mL）由泰州市姜堰中醫(yī)院藥劑科提供，批號(hào)：20130917，250mL/瓶。氨芐西林 （珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司中山分公司），0.25g/粒，批號(hào)：30100304，以蒸餾水配成藥液。兔抗鼠AP-1抗體（aN-20），美國(guó)Santa Cruz公司，批號(hào)：sc-12629；兔抗鼠NF-κB p65抗體，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：bs-0465R；兔抗鼠PPAR-γ抗體，武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：bs-0530R；總蛋白試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司，批號(hào)：20131117。

1.3 儀器 MP100型16導(dǎo)生理記錄儀及其附件，美國(guó)BIOPAC公司；Synergy HT型紫外熒光酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；Olympus光學(xué)顯微鏡；瑞典產(chǎn)LKB-V超薄切片機(jī)；H-600日立型透射電鏡；S-450型日立掃描電鏡；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；ALC-MPA2000m型4導(dǎo)生理記錄儀及其附件，上海奧爾科特儀器公司；R-911型全自動(dòng)放免計(jì)數(shù)儀，中國(guó)藥科大學(xué)實(shí)業(yè)總公司；7160型日本日立全自動(dòng)生化分析儀。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥 SD雄性大鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組、模型組（生理鹽水 0.018g·kg-1·d-1）、陽(yáng)性藥物組 （氨芐西林0.4g·kg-1·d-1）和通解口服液低（8.5g·kg-1·d-1）、中 （17g·kg-1·d-1）、高 （34g·kg-1·d-1）劑量組，各組間體重?zé)o顯著性差異。預(yù)先分別灌胃生理鹽水或藥物，連續(xù)給藥2d，每日2次，最后一次灌胃給藥48h后開(kāi)始禁食不禁水，禁食12h后再灌胃給藥1次后造模。

2.2 造模 給藥后腹腔注射10%水合氯醛（3.0mL/kg）麻醉，舌下靜脈注射脂多糖 （LPS）8mg/kg復(fù)制MODS急性胃腸損傷大鼠模型[2]。符合臨床實(shí)際的MODS實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛻?yīng)具備的標(biāo)準(zhǔn)是：（1）損傷因素與臨床MODS常見(jiàn)誘因基本一致；（2）發(fā)病在致傷24h以后；（3）有 SIRS 的臨床表現(xiàn)；（4）有 2 個(gè)以上器官或系統(tǒng)的功能障礙；（5）有足夠的發(fā)病率和死亡率。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MODS的診斷依據(jù)與人類基本一致，即：誘因+SIRS+多器官功能障礙[3]。我們實(shí)驗(yàn)中大鼠出現(xiàn)生命體征變化，嚴(yán)重肝腎功能損傷，符合MODS診斷[4]。

2.3 指標(biāo)檢測(cè) 免疫組化法對(duì)回腸進(jìn)行PPAR-γ、AP-1、NF-κB蛋白表達(dá)檢測(cè)，建模6h后，各組大鼠麻醉后予脫頸處死，迅速取出回腸沿系膜緣剖開(kāi)，去除內(nèi)容物，PBS液漂洗，取上段回腸置于4%多聚甲醛固定，固定后的組織在PBS中漂洗5min×3次，上行脫水，將組織塊放入二甲苯中5～30min，石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切片，厚度為5μm，進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下胞漿呈棕黃色顆粒視為陽(yáng)性表達(dá)。每組取8個(gè)標(biāo)本檢測(cè)，應(yīng)用Image-ProPlus6.0分析軟件，每個(gè)標(biāo)本選取肌層區(qū)域，計(jì)算所選區(qū)域的面積（area）和所選區(qū)域內(nèi)免疫組化陽(yáng)性信號(hào)總的灰度值的乘積，最后以每組均值進(jìn)行比較。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)。 P＜0.05，P＜0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠回腸組織PPAR-γ表達(dá)顯著降低（P＜0.01），AP-1 表達(dá)顯著升高 （P＜0.01），NF-κB 也表現(xiàn)增加趨勢(shì)。與模型組比較，通解口服液低劑量組與陽(yáng)性藥物組大鼠PPAR-γ的改變不明顯（P＞0.05），通解口服液中、高劑量可顯著增加模型大鼠 PPAR-γ 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組均可明顯降低 AP-1、NF-κB 的表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01）。與陽(yáng)性藥物組比較，通解口服液中、高劑量對(duì)于上述指標(biāo)的改善更具優(yōu)勢(shì)（P＜0.05，P＜0.01）。 通解口服液各劑量組間比較，體現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。見(jiàn)表1。

空白對(duì)照組大鼠回腸組織可見(jiàn)PPAR-γ陽(yáng)性（呈棕黃色）表達(dá)，模型組、陽(yáng)性藥物組、通解口服液低劑量組大鼠PPAR-γ表達(dá)不顯（呈淺黃色），通解口服液中劑量組大鼠PPAR-γ表達(dá)明顯 （呈深黃色），高劑量組可見(jiàn)PPAR-γ陽(yáng)性（呈棕黃色）表達(dá)。見(jiàn)圖1。

空白對(duì)照組大鼠回腸組織未見(jiàn)AP-1陽(yáng)性表達(dá)，模型組大鼠見(jiàn)AP-1陽(yáng)性表達(dá)（呈棕黃色），陽(yáng)性藥物組和通解口服液低、中劑量組大鼠AP-1表達(dá)不明顯（呈淺黃色），通解口服液高劑量組大鼠回腸組織未見(jiàn)AP-1陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖2。

空白對(duì)照組大鼠回腸組織未見(jiàn)NF-κB陽(yáng)性表達(dá)，模型組大鼠見(jiàn)NF-κB陽(yáng)性表達(dá)（呈棕黃色）；陽(yáng)性藥物組和通解口服液低、中劑量組大鼠NF-κB陽(yáng)性表達(dá)不明顯（呈淺黃色），通解口服液高劑量組大鼠回腸組織未見(jiàn)NF-κB陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖3。

表 1 各組大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達(dá)比較（±s）

表 1 各組大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達(dá)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽(yáng)性藥物組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與通解口服液低劑量組比較，※P＜0.05，※※P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)（只）陽(yáng)性藥物組 8 1.06±0.42** 1.25±0.46*通解口服液低劑量組 8 1.50±0.53* 1.13±0.58*通解口服液中劑量組 8 0.94±0.56**△※ 0.81±0.26**△※劑量（mg/kg）PPAR-γ空白對(duì)照組通解口服液高劑量組 8 0.88±0.52**△△※ 0.69±0.26**△△※※- 2.50±0.53**- 1.63±0.52 0.4 1.63±0.74 8.5 1.75±0.71 17 2.25±0.71*△34 2.50±0.53**△△※AP-1 8 NF-κB 0.94±0.18**1.31±0.59模型組82.00±0.53 2.00±0.76

圖1 各組大鼠回腸組織PPAR-γ表達(dá)的病理圖片（HE，×400）

4 討論

MODS是指機(jī)體遭受嚴(yán)重急性損傷后，由于失控的全身炎癥反應(yīng)，使機(jī)體在短時(shí)間內(nèi)（＞24h）同時(shí)或序貫出現(xiàn)兩個(gè)或兩個(gè)以上系統(tǒng)器官功能障礙的臨床綜合征，而醫(yī)學(xué)界普遍認(rèn)為胃腸道是促發(fā)MODS的始動(dòng)器官和靶部位。胃腸功能狀態(tài)被認(rèn)為是判斷危重病人預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。胃腸運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)有助于有效阻斷MODS的進(jìn)一步發(fā)展。目前針對(duì)MODS胃腸功能損傷尚無(wú)特效藥，臨床上主要采用腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、抑酸、改善腸動(dòng)力等治療，但療效并不理想，因此采用中醫(yī)藥干預(yù)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。我們既往研究發(fā)現(xiàn)，通瘀解毒法有助于改善MODS患者胃腸功能，因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)做一次機(jī)理探索。

PPAR-γ是一類依賴配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，參與許多生理反應(yīng)的調(diào)節(jié)，其生物學(xué)功能復(fù)雜多樣，包括調(diào)控脂肪和糖代謝、脂肪細(xì)胞終末分化、抗肝纖維化作用，減輕細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)臟器功能等。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ及其激動(dòng)劑在抗缺血再灌注損傷方面起著重要作用，是細(xì)胞炎癥及缺血反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[5]。PPAR-γ被其天然與合成配體激活后，可抑制炎性細(xì)胞因子白介素-1（IL-1）、IL-6及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的分泌，抑制黏附因子ICAM-1及P-選擇素、E-選擇素等的表達(dá)，同時(shí)也能減少誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、改善血管內(nèi)皮功能的作用。上述炎性因子的表達(dá)均依賴于轉(zhuǎn)錄因子：激活蛋白-1（AP-1）、核轉(zhuǎn)錄因子 κB（NF-κB）的活性而發(fā)揮作用，而活化的PPAR-γ可以抑制二者的活性。臨床研究表明，MODS患者PPAR-γ活性明顯下調(diào)[6]。膿毒血癥及腸炎患者體內(nèi)PPAR-γ表達(dá)減少，IL-1、IL-6及 TNF-α 表達(dá)水平較高[7-8]，特別是MODS患者。因此上調(diào)PPAR-γ的表達(dá)在MODS急性胃腸損傷的防治中有重要的意義。

圖2 各組大鼠回腸組織AP-1表達(dá)的病理圖片（HE，×400）

圖3 各組大鼠回腸組織NF-κB表達(dá)的病理圖片（HE，×400）

我們經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床觀察，發(fā)現(xiàn)MODS起病急驟，病情重篤，發(fā)生變證時(shí)多有毒，傷血?jiǎng)友獢⊙跽弑赜卸荆∏轭B固纏綿者常蘊(yùn)毒，癥見(jiàn)穢濁者則有毒。MODS的臨床特點(diǎn)和病理演變符合中醫(yī)學(xué)“毒”的特性，而急性胃腸功能損傷則是“熱從毒化，變從毒起，瘀從毒結(jié)”的結(jié)果之一。我們抓住MODS急性胃腸損傷“毒瘀互結(jié)”的病理中心，以“六腑以通為用”之要義，確立了通瘀解毒的治療大法，并研制出通解口服液應(yīng)用于臨床。通解口服液中大黃、敗醬草解毒通瘀，既能清解熱毒，又能化瘀通腑，共為君藥；配伍枳實(shí)、蒲黃、茜草，達(dá)到疏與通合，清與散配，化瘀而不動(dòng)血，止血而不留瘀的效果。既往研究發(fā)現(xiàn)通解口服液可改善MODS患者胃腸功能[9]，對(duì)MODS大鼠炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用[4]。本研究以回腸PPAR-γ、NF-κB和AP-1蛋白的表達(dá)為觀察指標(biāo)，評(píng)估通解口服液對(duì)PPAR-γ、NF-κB和AP-1調(diào)控作用。結(jié)果顯示，各劑量的通解口服液均可上調(diào)MODS模型大鼠回腸組織PPAR-γ的表達(dá)，降低NF-κB和AP-1的表達(dá)，且以中、高劑量組改善程度更明顯，認(rèn)為通解口服液對(duì)MODS模型大鼠回腸組織 PPAR-γ、AP-1、NF-κB 表達(dá)的影響與其劑量有一定的相關(guān)性。通解口服液可能是通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用防治MODS。下一步我們將更深入地研究PPAR-γ、炎癥因子與腸平滑肌細(xì)胞之間的相關(guān)性，從微觀角度探討通解口服液防治MODS胃腸損傷的作用靶點(diǎn)。

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