抗疏健骨顆粒醇提工藝優(yōu)選研究

史傳道 杜 星 郭東艷 王 露 曹 瑞

（陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西咸陽712046）

抗疏健骨顆粒由淫羊藿、杜仲、牛膝、白術(shù)、丹參等藥味組成，具有補腎健脾、活血壯骨的功效，主要用于脾腎兩虛、氣血瘀阻導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松癥。淫羊藿、杜仲為方中的主要藥味，現(xiàn)代藥理研究表明，兩味藥中的成分具有抗骨質(zhì)疏松作用[1-4]。結(jié)合文獻報道及預(yù)實驗結(jié)果，本實驗擬在單因素實驗篩選的基礎(chǔ)上，以淫羊藿苷、總黃酮含量及醇浸出物得率的加和作為綜合評價指標，采用星點設(shè)計響應(yīng)面分析法對乙醇回流提取工藝進行考察，為抗疏健骨顆粒劑的進一步研究提供參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料 淫羊藿 （批號：130401）、杜仲 （批號：130501），購于西安盛興中藥飲片有限責(zé)任公司；淫羊藿苷對照品 （供含量測定用，批號：110737-200415），出自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純（Honeywell）；水為過濾后的娃哈哈純凈水。

1.2 儀器 安捷倫1260型高效液相色譜儀（G1311C型四元泵，G1329B型進樣器，G4212B型二極管陣列檢測器，ChemStation for LC 3D systems），UV-2550紫外可見分光光度計 （日本島津），Sartorius MC電子天平 （十萬分之一），METTLER TOLEDO（AL204）電子天平（萬分之一），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，D101型電熱鼓風(fēng)干燥箱，SAITEXIANGYI 530離心機。

2 方法與結(jié)果

2.1 淫羊藿苷含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相： 乙腈-水 （30∶70）； 流速：1.0mL/min；檢測波長為 270nm；柱溫：20℃。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密移取各樣品液1mL，置10mL量瓶中，加入70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取淫羊藿苷對照品溶液 （濃度 0.1mg/mL）1、2、4、6、8、10、12μL，按2.1.1項下色譜條件，測定峰面積。以峰面積A對淫羊藿苷含量C（μg）進行線性回歸，計算回歸方程為：y=730.19x+3.1022，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，淫羊藿苷在0.1～1.2μg之間線性關(guān)系良好。

2.1.5 樣品測定 精密吸取供試品溶液與對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，依據(jù)2.1.1項下色譜條件，記錄峰面積，采用外標一點法計算淫羊藿苷的含量。

2.2 醇浸出物得率的測定 精密吸取各濃縮定容至100mL的提取液10mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，置干燥器中冷卻30min，迅速精密稱定重量。按公式計算醇浸出率：醇浸出物得率（%）=[浸膏重量×10/藥材重量]×100%。

2.3 總黃酮含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1mL含0.1mg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密移取樣品液1mL至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 標準曲線的繪制 精密吸取淫羊藿苷對照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL 置具塞容量瓶中，分別加甲醇定容至10mL。以甲醇為空白參比，在270nm波長處測定吸光度。以吸光度A值對淫羊藿苷濃度C進行線性回歸。結(jié)果表明：當淫羊藿苷的濃度在0.005～0.025mg/mL范圍內(nèi)，濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：A=50.789C-0.0120，R2=0.9992。

2.3.4 總黃酮含量測定 分別取供試品溶液和對照品溶液，以相應(yīng)試劑甲醇為空白，照紫外-可見分光光度法，在270nm波長處測定吸光度值，代入標準曲線計算含量。

2.4 星點設(shè)計法優(yōu)化提取工藝

2.4.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)星點設(shè)計的原理，選擇影響醇提工藝的三個因素：乙醇濃度（X1）、 提取時間 （X2）、溶媒比（X3）進行考察，由于提取次數(shù)為非連續(xù)性數(shù)據(jù)，回歸處理較為困難，故以單因素進行考察，最終確定提取次數(shù)為2次。上述三個因素每個設(shè)三個水平，用代碼值-1、0、1來表示。因素水平見表1，實驗安排和結(jié)果見表2。[5-6]

2.4.2 模型擬合 采用Design-Expert 8.0.6軟件，對表2中數(shù)據(jù)以綜合評分對自變量進行多元線性回歸和二項式擬合，得多元線性回歸：r=0.6426，P＜0.0001。由r值可以看出，擬合度不佳，因此線性模型不合適。得二項式擬合：r=0.9943，簡化后的二項式方程為：Y=94.89-1.44X1+4.47X2+1.36X3+0.079X1X2+0.17X1X3-0.16X2X3-4.51X12-1.70X22+0.32X32，r=0.9839，相對于線性擬合模型有大幅度提高，表明該方程有較大可信度。擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見表3。

2.4.3 工藝優(yōu)化與預(yù)測 固定3個變量中的一個為中值，再以擬合的目標函數(shù)為數(shù)學(xué)模型，繪制因變量曲面圖。結(jié)果見圖1～3。在圖上選取提取較佳的工藝為——X1：68.96%，X2：8.12倍量，X3：117.58min?？紤]到實驗生產(chǎn)中的可操作性，選擇乙醇濃度（X1）70%，溶劑用量（X2）8 倍量，提取時間（X3）120min 為最佳工藝條件。

表1 星點設(shè)計因素與水平

表2 星點試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 擬合回歸方程的方差分析結(jié)果

圖1 乙醇濃度與提取時間對提取效果的影響

圖2 乙醇濃度與溶劑倍量對提取效果的影響

圖3 溶劑倍量與提取時間對提取效果的影響

2.4.4 驗證試驗 按處方比例稱取淫羊藿、杜仲藥材3份，每份105g，加8倍量70%乙醇，提取2次，每次120min，測定淫羊藿苷含量、總黃酮含量及醇浸出物得率。結(jié)果表明：經(jīng)優(yōu)化后的工藝提取所得實測值與理論值接近，偏差在3%以內(nèi)，所選工藝條件合理，穩(wěn)定可行，見表4。

表4 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

淫羊藿中黃酮類成分是其發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松藥理作用的主要有效成分，據(jù)統(tǒng)計，在治療骨質(zhì)疏松癥的常用中藥中，淫羊藿的使用頻率居首位[7]。杜仲中含有大量的活性物質(zhì)，成分復(fù)雜，但是化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相近，活性成分單體的提取分離較為困難[8]。杜仲能增強骨的力學(xué)性能，改善骨質(zhì)量，從而能減少骨質(zhì)疏松癥骨折并發(fā)癥的發(fā)生，同時也增加了骨量，促進骨形成。因此，在本方中結(jié)合淫羊藿、杜仲中所含成分的理化性質(zhì)及現(xiàn)代藥理研究結(jié)果，選擇淫羊藿苷、總黃酮及醇浸出物作為綜合評價指標，優(yōu)選醇提的最佳工藝條件，其較單一指標更加科學(xué)合理。

本試驗建立了淫羊藿苷含量、總黃酮含量及醇浸出得率的測定方法。通過星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選所得的最佳提取工藝為8倍量70%乙醇，提取2次，每次120min，提取預(yù)測值與理論值偏差為-1.14%，二項式擬合復(fù)相關(guān)系數(shù)r=0.9839。最佳條件下效應(yīng)的預(yù)測值和實測值偏差較小，結(jié)果較好。

[1] 王俊勤，胡有谷，鄭洪軍，等.淫羊藿苷對體外培養(yǎng)成骨細胞增殖和分化的影響.中國臨床康復(fù)，2002，6（9）：1307

[2] 馬慧萍，賈正平，白孟海，等.淫羊藿總黃酮對大鼠實驗性骨質(zhì)疏松生化學(xué)指標的影響.中國藥理學(xué)通報，2003，19（2）：187

[3] 肖靜，李三華，莫寧萍，等.杜仲總黃酮對體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞增殖的影響.遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，31（3）：238

[4] 梁翔，彭太平，劉勝才，等.杜仲對大鼠骨髓基質(zhì)細胞增殖及成骨分化影響的實驗研究.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2007，19（3）：58

[5] 李瑾.太白楤木保肝活性部位的制備及其制劑前研究.咸陽：陜西中醫(yī)學(xué)院，2012

[6] 郭東艷，覃鴻恩，唐志書，等.基于譜效相關(guān)的星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化太白楤木提取工藝.西北藥學(xué)雜志，2012，27（5）：399

[7] 康學(xué)，劉仁慧，王秀娟.淫羊藿、女貞子抗骨質(zhì)疏松癥的應(yīng)用與機制研究進展.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，28（1）：332

[8] 劉慧，劉仲華，張盛.杜仲中活性成分的研究進展.農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2011（8）：12