非誘導型基因重組工程菌發(fā)酵產(chǎn)人血清白蛋白各種參數(shù)的變化規(guī)律

戰(zhàn)偉超，李辰雨，徐世艾 *，林 劍

（1.煙臺大學 生命科學學院，山東 煙臺 264005；2.煙臺大學 化學化工學院，山東 煙臺 264005）

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是人血漿中最豐富的蛋白成分[1]，占血漿總蛋白的60%，每升成人血液中約有40 g 白蛋白，占血清總蛋白的（58±4）%[2-3]。人血清白蛋白不僅在中國，在世界上都擁有巨大的市場[4]，其主要作用是維持血液正常滲透壓，同時也是運輸外源性和內源性物質必不可缺的載體[5-6]；最新研究還發(fā)現(xiàn)人血清白蛋白與CD4受體形成的融合蛋白（HSACD4），有望成為阻止艾滋病病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染的阻斷劑[7]：這種融合蛋白能夠阻斷艾滋病病毒感染CD4+淋巴細胞的途徑[8]，因此可以將其作為一種特效藥進行更深層次的研究。當前，白蛋白類藥物制劑多數(shù)來源于血液的直接提取[9-11]，但是由于檢測技術的不完善和血液來源的不穩(wěn)定性及缺乏性，極易導致使用者感染艾滋病病毒或其他可以通過血液傳播的疾病[12]。不僅僅如此，如果只是從血液中提取人血清白蛋白用于醫(yī)用，是遠遠無法滿足市場的巨大需求的[13-15]，因此尋找一種新型的、安全的、可以大量生產(chǎn)白蛋白的方法迫在眉睫。采用轉基因非誘導型畢赤氏酵母（Pichia pastoris）表達重組人血清白蛋白（recombinant HSA，rHSA），與目前文獻報道的廣泛采用的甲醇誘導型畢赤氏酵母[16]相比，具有下列優(yōu)點：首先該菌株發(fā)酵過程中不需要添加甲醇誘導劑[17]，這種優(yōu)勢降低了發(fā)酵過程中補料的危險系數(shù)，減少了染菌的可能性，產(chǎn)品的分離純化可實現(xiàn)無污染排放；其次是在其發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源以葡萄糖為主，降低了甘油的使用量，能夠有效的降低生產(chǎn)成本。另外該轉基因非誘導型畢赤氏酵母在構建過程中將目的基因插入到表達甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）蛋白序列的前端，從理論上講該工程菌表達的白蛋白應該是隨著菌體的生長的而進行的，整個發(fā)酵周期明顯縮短。

本實驗以轉基因非誘導型畢赤氏酵母為菌株，研究了該菌株在發(fā)酵過程中的生長規(guī)律、pH值的變化規(guī)律、人造血清白蛋白的產(chǎn)生規(guī)律等，為利用轉基因非誘導型畢赤氏酵母高密度發(fā)酵產(chǎn)重組血清白蛋白提供了一定的研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

轉基因非誘導型畢赤氏酵母菌株（Pichia pastoris）NCY-1：山東大學應用生命科學研究中心構建。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂30 g/L。

種子培養(yǎng)基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L。

搖瓶培養(yǎng)基：酵母提取物20 g/L，葡萄糖40 g/L，山梨醇15 g/L，甘油15 g/L，KH2PO42 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.10 g/L，營養(yǎng)鹽0.10 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物40 g/L，葡萄糖40 g/L，山梨醇30g/L，KH2PO42g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.10g/L，營養(yǎng)鹽10mL/L（單獨滅菌），消泡劑1 mL/L。

營養(yǎng)鹽：ZnSO4·H2O 20 g/L，MgSO4·7H2O 40 g/L，MnSO4·H2O 10 g/L。

1.1.3 化學試劑

酵母浸粉：FM888 安琪酵母股份有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）標準品：北京索萊寶科技有限公司。其余試劑均為國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)的分析純試劑。

1.2 儀器與設備

10JSA全自動代謝流發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；DK-98-11多功能萬用爐：天津泰斯儀器有限公司；Waters 1525液相色譜儀：美國Waters公司；Anke TKL-5-A離心機：上海標儀儀器有限公司；Motic BA310雙目顯微鏡：北京汗盟紫星儀器儀表有限公司；AR1530電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；G180TW全制動高壓滅菌鍋：致微儀器有限公司；XB-K-25型血細胞計數(shù)板：浙江省玉環(huán)縣求精醫(yī)用儀器廠；SW-CJ-2FD超凈工作臺：蘇潔凈化設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子培養(yǎng)

按10%的裝液量，分別取2個3 L的錐形瓶裝入300 mL的種子液，121 ℃、20 min、0.12 MPa滅菌后，在超凈工作臺上分別用接種針接入一環(huán)菌，放入恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min、30 ℃培養(yǎng)16 h。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

按10%的裝液量，在3 L錐形瓶中裝入300 mL的發(fā)酵液，121 ℃、20 min、0.12 MPa滅菌后，在超凈工作臺上按10%的接種量接種，放入恒溫培養(yǎng)箱中220 r/min、30 ℃培養(yǎng)70 h。

1.3.3 機械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)

在挑取一定量的菌分別接種到兩個3 000 mL的錐形瓶中，裝液量為300 mL，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)16～18 h后，按10%體積比的接種量接種到10 L的機械式攪拌發(fā)酵罐中，控制通風比為1∶0.7，罐壓0.02 MPa，攪拌轉速350 r/min，溫度30 ℃發(fā)酵90 h。

1.3.4 NCY-1菌株發(fā)酵液對白蛋白的水解

根據(jù)文獻報道，甲醇誘導型菌株在合成白蛋白的過程中能夠分泌蛋白酶并將發(fā)酵液中的白蛋白水解[13]，導致發(fā)酵后期白蛋白濃度下降。盡管該菌株為非誘導型，但是也可能存在同一現(xiàn)象，為此設計了以下實驗。

取一定體積的發(fā)酵液，在5 500 r/min條件下，常溫離心10 min分離掉發(fā)酵液中的酵母細胞。分別取20 mL上清液，一份準確直接加入1.00 g的牛血清白蛋白，一份加熱到100 ℃保溫10 min滅掉酶活后冷卻到常溫，再加入1.00 g牛血清白蛋白。另取20 mL新配的發(fā)酵液加入1.00 g牛血清白蛋白作為空白對照。將上述3份溶液同時放在30 ℃水浴鍋中保溫10 h后分別測其溶液中殘留的白蛋白含量。

1.3.5 分析方法

（1）菌體濃度：顯微鏡直接計數(shù)法[18]。

（2）重組人血清白蛋白檢測方法[19]。

重組人血清白蛋白采用高效液相色譜法測定，色譜條件如下：

流動相：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），1%異丙醇，0.05%三氮化鈉（NaN3）；凝膠色譜柱：TOSOH TSK-GEL G3000SW（7.8 mm×30 cm）；流速0.6 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃，進樣量：20 μL。

牛血清白蛋白標準曲線的制備：準確稱取0.10 g的牛血清白蛋白用去離子水定容于100 mL容量瓶配制成為1 g/L牛血清白蛋白標準溶液，用去離子水將標準溶液稀釋為100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L牛血清白蛋白標準使用液，分別取不同質量濃度的稀釋液20 μL進樣，得出不同的峰面積并繪制標準曲線。

（3）其他指標

葡萄糖的含量采用費林試劑滴定法[20]；白蛋白含量采用考馬斯亮藍法測定[21]；銨根離子（NH4+）含量采用靛酚藍-分光光度法測定[22]。

2 結果與分析

2.1 高效液相色譜法測牛血清白蛋白標準曲線

以峰面積（x）為橫坐標，牛血清蛋白質量濃度（y）為縱坐標，繪制牛血清白蛋白標準曲線如圖1所示。由圖1可知，標準曲線的回歸方程為y=19.791 0x+4.580 1，相關系數(shù)R2=0.999 6，表明二者線性關系良好。

圖1 牛血清白蛋白標準曲線Fig.1 Standard curve of BSA

2.2 10 L機械攪拌式發(fā)酵罐培養(yǎng)結果

2.2.1 菌體濃度及葡萄糖量對rHSA的影響

圖2 rHSA分批發(fā)酵實驗結果Fig.2 Experimental results of rHSA batch fermentation

由圖2可知，該基因工程菌在前8 h為延滯期，此時菌體數(shù)目基本保持不變，發(fā)酵液中白蛋白含量為0；8 h后菌體進入對數(shù)生長期，菌體大量增殖，菌體開始不斷地代謝碳源，將發(fā)酵液鏡檢觀察到發(fā)酵液中的畢赤氏酵母多方位出芽，并且存在大量的體型較小的“小”酵母；30 h前，發(fā)酵液中存在rHSA但含量極低，在36 h時，對數(shù)生長期結束，發(fā)酵液中菌體體型形態(tài)正常，極少數(shù)菌體仍處于出芽狀態(tài)，菌體最大濃度達到3.0×109個/mL，隨后菌體進入平穩(wěn)期，菌體濃度不再大幅上升，發(fā)酵液中的rHSA達到最大值160 mg/L，但隨著時間的延續(xù)發(fā)酵液中的rHSA被不斷降解時發(fā)酵液中的rHSA含量降低。菌體進入穩(wěn)定期后，發(fā)酵液中的殘?zhí)橇炕颈３植蛔兙S持在5 g/L附近。因此，在10 L機械式攪拌發(fā)酵罐水平上，菌體在30 h后進入平穩(wěn)期，發(fā)酵液中rHSA產(chǎn)量達到最高160 mg/L。

2.2.2 溶氧與重組人血清蛋白含量的關系

溶氧在發(fā)酵過程中不斷變化，其與rHSA含量的關系見圖3。

由圖3可知，當菌體進入對數(shù)生長期后，溶氧（dissolved oxygen，OD）值一直保持在一個較低的水平，低水平的溶氧值一直維持到了穩(wěn)定期的后期，當rHSA被大量水解后，發(fā)酵液的DO值迅速上升，此時發(fā)酵液能聞到一股乙醇的味道，發(fā)酵液中的NCY-1菌體開始進入無氧呼吸階段。因此當發(fā)酵液中的DO值突然升高時可以作為結束發(fā)酵的一個考慮指標。

圖3 DO和rHSA 的關系Fig.3 Relationship between DO and rHSA

2.2.3 補料對菌體濃度和rHSA產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵后期由于碳源的不足導致菌體濃度不再增加，發(fā)酵液中的rHSA產(chǎn)量也不再上升，因此考慮到了通過后期補料的方法來刺激菌體的二次生長。補加葡萄糖及甘油對菌體濃度影響的實驗結果如圖4所示。

圖4 補料對菌體濃度的影響Fig.4 Effect of feeding on the concentration of yeast

由圖4可知，后期（發(fā)酵時間30 h后）補加10 g/L葡萄糖或是10 g/L甘油都會刺激菌體的二次生長，但是葡萄糖促使菌體二次生長的效果明顯要高于甘油。補料后2 h分別對發(fā)酵液中的菌體濃度及rHSA產(chǎn)量進行了測定，發(fā)現(xiàn)補加了葡萄糖的發(fā)酵液中菌體濃度及rHSA的最高產(chǎn)量可分別達到4.95×109個/mL及185 mg/L，而補加了甘油的發(fā)酵液中菌體濃度及rHSA的最高產(chǎn)量可分別達到3.85×109個/mL及176 mg/L。NCY-1產(chǎn)rHSA的作用機理是將目的基因插入到甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GADP）蛋白序列的前端，所以只要發(fā)酵液中的NCY-1表達3-磷酸甘油醛脫氫酶，發(fā)酵液中就應該表達外源插入的rHSA基因。甘油是三碳化合物，在甘油激酶的催化下，磷酸化成3-磷酸甘油，然后經(jīng)氧化脫氫酶變成磷酸二羥丙酮再經(jīng)3-磷酸甘油醛脫氫酶進入糖酵解途徑（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）。但是由于發(fā)酵液中的葡萄糖效應以及發(fā)酵液中加入甘油后會形成甘油二酯和甘油三酯等物質，所以促進菌體生長及rHSA產(chǎn)生的效果不如葡萄糖，因此若想通過后期（發(fā)酵時間30 h后）補加的方式來增加rHSA的產(chǎn)量，優(yōu)先選擇流加10 g/L葡萄糖。

2.3 3 L搖瓶水平的實驗結果

2.3.1 發(fā)酵液中蛋白酶的研究結果

在3 L搖瓶水平發(fā)酵結束后，分別取出20 mL發(fā)酵液，加入1.00 g rHSA，再取20 mL蒸餾水加入1.00 g rHSA作為空白組實驗。結果如表1所示。

表1 加熱處理對rHSA含量的影響Table 1 Effect of heat treatment on rHSA content

由表1可知，沒有加熱處理的發(fā)酵液，經(jīng)過30 ℃的保溫處理10 h后，加入的1.00 g牛血清白蛋白完全被水解，而經(jīng)過加熱處理的發(fā)酵液盡管經(jīng)過30 ℃的保溫處理10 h后，其白蛋白濃度基本保持不變，這充分說明菌株NCY-1在合成白蛋白的過程中也能夠分泌一定量的胞外蛋白酶，導致發(fā)酵液中的rHSA被降解?？瞻自囼炚f明新配的發(fā)酵液中沒有蛋白酶，所以蛋白酶的來源并非是原始發(fā)酵液而是在后期的發(fā)酵過程中產(chǎn)生的，所以要想提高發(fā)酵液中rHSA的產(chǎn)量需要在后期注意抑制蛋白酶的活力。

2.3.2 硫酸銨對發(fā)酵液中rHSA含量的影響

為探究發(fā)酵液中銨離子對rHSA含量的影響，在3 L搖瓶水平上進行了如下實驗，在實驗組中，始終維持發(fā)酵液中的（NH4）＋質量濃度在3.0 g/L，而空白組不做任何處理，實驗結果如圖5所示。

圖5 銨離子濃度對rHSA含量的影響Fig.5 Effect of NH4+concentration on rHSA content

由圖5可知，發(fā)酵時間＜46 h，空白組中的rHSA的含量略高于實驗組，原因可能是在發(fā)酵前期，硫酸銨影響了發(fā)酵液中的pH值，使溶液pH值高于NCY-1的最適生長pH值，影響了菌體的正常生長，所以前期空白組中蛋白表達量較高。發(fā)酵時間＞46 h以后，菌體進入穩(wěn)定期，空白組蛋白的表達量明顯低于實驗組，可能原因是，發(fā)酵液中存在的硫酸銨不僅抑制了蛋白酶的活性，還為NCY-1合成白蛋白提供了充足的銨離子，所以使得發(fā)酵液中的蛋白含量偏高，但是發(fā)酵時間＞56 h后，白蛋白的含量還是有所下降，可能原因是發(fā)酵液中的碳源不足，導致rHSA被分解。所以在后期實驗可以考慮在菌體進入穩(wěn)定生長期約30 h時再補加硫酸銨，使流加后發(fā)酵液中的銨離子濃度始終維持在3.0 g/L。

3 結論

由于種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基組成成分相似，所以種子液一經(jīng)接種到10 L機械攪拌式發(fā)酵罐中，菌體立刻入了對數(shù)生長期，30 h后菌體進入平穩(wěn)期，菌體能達到的最大菌體濃度為3.0×109個/mL，最大rHSA產(chǎn)量為160 mg/L，30 h后在發(fā)酵罐中補加10 g/L葡萄糖后，最大產(chǎn)量可達到185 mg/L；而在3 L搖瓶基礎上的實驗得出發(fā)酵液中確實存在較高活性的蛋白酶，但若始終保持發(fā)酵液中銨離子含量為3.0 g/L時，能有效的緩解發(fā)酵液中的rHSA的降解速度，提高發(fā)酵液中rHSA的產(chǎn)量。在后續(xù)實驗中可以考慮將硫酸銨的作用放大到10 L發(fā)酵罐中，以期達到更好的效果。

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