酮基還原酶基因工程菌發(fā)酵特性的研究

張 松，李 嘯， *，石小丹，程 奔

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌 443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

手性醇是手性藥物合成的重要中間體，例如（R）-（+）-4-氯-3-羥基丁酸乙酯（ethyl（R）-（+）4-chloro-3-hydroxybutanoate，（R）-CHBE）是非常重要的手性中間體[1]，它可用于合成阿伐他汀鈣系列的藥物如L-肉毒堿[2]、大環(huán)內(nèi)酯A和（R）-γ-氨基-β-羥基丁酸[（R）-γ-amino-β-hydroxybutyric acid，GABOB]等[3]。

微生物法催化酮類化合物制備手性醇具有效率高、選擇性強、成本低、裝置簡單、環(huán)境污染少等顯著優(yōu)勢，受到了人們的廣泛關(guān)注[4]。微生物來源的酮基還原酶（ketoreduetase，KR）主要為醛酮還原酶系[5]，屬于短鏈醇脫氫酶家族（shortchain alcohol dehydrogenase，SDR）。重組大腸桿菌酮基還原酶一般為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）依賴型，當KR 與NADPH 結(jié)合時，KR空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，執(zhí)行由NADPH提供的、Tyr151 羥基介導(dǎo)的質(zhì)子轉(zhuǎn)移，完成酮類化合物的還原[6]。目前的研究主要集中于酮基還原酶的基因改造、輔酶再生以及生物催化過程優(yōu)化[4]，而對于酮基還原酶發(fā)酵調(diào)控方面的報道較少。

大腸桿菌高密度發(fā)酵是現(xiàn)代發(fā)酵領(lǐng)域逐漸興起的一項新技術(shù)，基因重組改造過的工程菌只有經(jīng)過進一步的高密度發(fā)酵優(yōu)化，才能應(yīng)用于實際的工業(yè)生產(chǎn)[7]。當前有關(guān)酮基還原酶發(fā)酵方面的研究仍然停留在搖瓶發(fā)酵水平，要想酮基還原酶真正能用于工業(yè)發(fā)酵，中試水平的酮基還原酶高密度發(fā)酵產(chǎn)酶研究無疑具有重要意義。課題主要對重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酮基還原酶的發(fā)酵特性進行了研究，以確定重組菌株菌體生長狀況、發(fā)酵液重要參數(shù)指標、菌體產(chǎn)酶情況以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性。為了進一步考察發(fā)酵特性曲線和質(zhì)粒穩(wěn)定性，采用流加氨芐的策略進行了補料分批發(fā)酵，并進行了多參數(shù)相關(guān)分析和前后兩罐對比分析。實驗為后續(xù)發(fā)酵過程優(yōu)化以及生產(chǎn)放大奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌（Escherichia coli）KR-C：安琪酵母股份有限公司菌種室。

1.1.2 試劑

L-阿拉伯糖：美國Sigma 公司；酵母蛋白胨（FP101）、酵母抽提物（FM888）：安琪酵母股份有限公司；氨芐西林鈉（注射用）：中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母蛋白胨（FP101）10 g/L，NaCl 10 g/L，酵母抽提物（FM888）5 g/L，瓊脂粉15 g/L。

種子搖瓶液體培養(yǎng)基：甘油10 g/L，酵母抽提物13.5g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

50 L發(fā)酵罐液體培養(yǎng)基：甘油20 g/L，酵母抽提物13.5 g/L，酵母蛋白胨31.5 g/L，KH2PO42.31 g/L，K2HPO412.54 g/L，MgSO40.5 g/L。

1.1.4 補料溶液

L-阿拉伯糖：質(zhì)量濃度0.1 g/mL；氨芐西林鈉：質(zhì)量濃度0.1 g/mL。

1.2 儀器與設(shè)備

ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司；FUS-50L（A）型新概念發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；TDL-60B型飛鴿牌系列離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠制造；SP-754型紫外可見光分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；04711-45型超聲波破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)方法

一級種子培養(yǎng)：將斜面菌樣接入裝料量為25 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，制備2瓶，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

二級種子培養(yǎng)：將6 mL一級種子液接入裝料量為600 mL液體培養(yǎng)基的5 L三角瓶中，于30 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)12 h。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：發(fā)酵罐滅菌前加入15 mL消泡油，調(diào)節(jié)pH值為7，滅菌后將600 mL二級種子液接入裝有30 L液體培養(yǎng)基的50 L發(fā)酵罐中，于30 ℃、200～480 r/min（溶氧轉(zhuǎn)速聯(lián)動）、0.035 MPa條件下發(fā)酵培養(yǎng)，當菌體量OD600nm值為2時，一次性加入配制好的0.1 g/mL的L-阿拉伯糖溶液300 mL。

氨芐流加培養(yǎng)：其他培養(yǎng)條件及誘導(dǎo)條件同分批發(fā)酵培養(yǎng)，在加入誘導(dǎo)劑的同時，一次性加入100 mg/L的氨芐30 mL。

1.3.2 測定指標

罐上在線數(shù)據(jù)：pH、溫度、攪拌轉(zhuǎn)速、耗氧速率（oxygen consumption rate，OUR）、二氧化碳釋放速率（carbon-dioxide evolution rate，CER）、呼吸商（respiratory quotient，RQ）、溶解氧（dissolved oxygen，DO）等。

發(fā)酵過程中每2 h測一次OD600nm、氨基酸態(tài)氮和乙酸含量，每4 h測一次酮基還原酶酶活?；罹鷶?shù)和質(zhì)粒穩(wěn)定性的取樣點由細胞生長周期數(shù)據(jù)需求進行選擇。菌體量測定：發(fā)酵液用蒸餾水稀釋適當?shù)谋稊?shù)，振蕩混合搖勻后，用紫外可見光分光光度計測定波長600 nm處的光密度值（OD600nm）。采用國際酶學(xué)委員會規(guī)定的定義酶活：40 ℃，pH值為6.0條件下，每分鐘消耗1 μmol NADPH所需要的酶量為1個酶活單位（U/L）?；罹鷶?shù)測定：采用稀釋涂布平板法，將發(fā)酵液進行適當?shù)奶荻认♂專謩e涂布到瓊脂平板表面，37 ℃培養(yǎng)24 h后檢查平板上菌落形成單位（colony forming unit，CFU）數(shù)量。酮基還原酶酶活測定方法見參考文獻[8]。發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮測定：甲醛滴定法，見參照文獻[9]。發(fā)酵液乙酸含量測定：測定方法見參考文獻[10]。質(zhì)粒穩(wěn)定性測定：平行平板法，見參照文獻[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組大腸桿菌KR-C在50 L發(fā)酵罐中生長規(guī)律研究

2.1.1 發(fā)酵過程中在線測定參數(shù)的變化

探索了50 L發(fā)酵罐的重組大腸桿菌KR-C的生長規(guī)律，發(fā)酵過程的在線參數(shù)檢測結(jié)果見圖1。

圖1 發(fā)酵過程在線參數(shù)的變化趨勢Fig.1 Trends of real-time parameters in the fermentation process

由圖1CER與OUR曲線分析可知，菌體在0～4 h呼吸強度較弱，4～8 h呼吸強度呈指數(shù)增長，8～10 h CER與OUR達到最大值后趨于穩(wěn)定，10～12 h呼吸強度經(jīng)過急劇下降后出現(xiàn)了二次增長現(xiàn)象，此時溶氧也出現(xiàn)了短暫的回落，13 h后呼吸強度又一次急劇下降后一直處于較低的水平；從pH 曲線分析可知，發(fā)酵液的pH值在前6 h幾乎穩(wěn)定不變，6～10 h后pH值逐漸下降，10～12 h pH值回升達到最大，12 h后pH值幾乎保持恒定。

2.1.2 發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、乙酸及酶活的變化

發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮、乙酸及酶活的變化結(jié)果見圖2。

圖2 發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮、乙酸及酶活隨發(fā)酵時間的變化趨勢Fig.2 Changing trends of amino acid nitrogen,acetic acid concentration and enzyme activity of fermentation broth with time

由圖2可知，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量在前4 h變化并不明顯，4～12 h 急劇下降，12～18 h緩慢上升后達到最低并趨于穩(wěn)定；乙酸在前6 h增長緩慢，6～10 h快速上升，10～12 h又迅速下降，12 h后趨于穩(wěn)定；酮基還原酶的酶活在12 h達到最大，12 h后酶活迅速下降。

2.1.3 發(fā)酵過程中OD600nm、活菌數(shù)及質(zhì)粒穩(wěn)定性的變化

圖3 發(fā)酵過程中重組大腸桿菌菌體的累積量(OD600nm)、活菌數(shù)以及質(zhì)粒穩(wěn)定性隨時間的變化趨勢Fig.3 Changing trends of the cumulative amount of the recombinant Escherichia coli (OD600nm),viable cells number and plasmid stability with time during fermentation

由圖3可知，重組大腸桿菌菌體的累積量（OD600nm）在0～4 h增長緩慢，4～12 h 呈指數(shù)增長，12 h后趨于穩(wěn)定；而活菌數(shù)在前10 h的變化趨勢與OD600nm相似，在10 h達到最大值，但10～20 h期間發(fā)酵液中的活菌數(shù)逐漸下降，20 h活菌數(shù)下降速度加快；帶質(zhì)粒的重組大腸桿菌在前10 h幾乎達到100%，10～20 h期間質(zhì)粒穩(wěn)定逐漸降低，20 h后，質(zhì)粒丟失速度加快，發(fā)酵結(jié)束后，帶質(zhì)粒的菌體僅占所有菌體的83%。

2.1.4 質(zhì)粒穩(wěn)定性

發(fā)酵22 h后質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測結(jié)果見圖4。

圖4 發(fā)酵22 h后質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測結(jié)果Fig.4 Determination results of plasmid stability after fermentation for 22 h

由圖4可知，在平皿上編號為2、17、20、24、31、33、48、50、57、66、84、88、86、91、95、96、97這17個區(qū)域內(nèi)加有氨芐的A平板里面沒有出現(xiàn)菌落，而沒有加氨芐的B平板里面長了菌落，由此證實大約有17%的活菌的質(zhì)粒在此時已經(jīng)丟失了。

2.1.5 重組大腸桿菌KR-C在發(fā)酵過程的變化

重組大腸桿菌KR-C在發(fā)酵過程的生長規(guī)律如下：

（1）在發(fā)酵前期（0～4 h）為延滯期，此期間為菌體的適應(yīng)期，表現(xiàn)為菌體生長速度較慢，總呼吸強度弱，碳源與氮源消耗速率低，pH值幾乎不變化，乙酸積累量不高；

（2）4～8 h為對數(shù)增長期，菌體適應(yīng)新環(huán)境后，活菌數(shù)、菌體累積量開始急劇增長，導(dǎo)致攝氧率以及呼出CO2增多，與此同時碳源被大量消耗，代謝副產(chǎn)物乙酸逐漸積累，pH逐漸降低，此過程菌體的累積為后續(xù)酮基還原酶的大量表達奠定了基礎(chǔ)；

（3）8～10 h為穩(wěn)定期，圖1中CER與OUR曲線分析可知此階段菌體的總呼吸強度幾乎不變，值得注意的是，此階段（圖3）菌體的累積量、活菌數(shù)仍不斷升高?？赡苁乔捌诰w的大量累積導(dǎo)致菌體生長環(huán)境中的能源以及溶氧的過度消耗，致使部分菌體提前進入呼吸衰弱期，而新增長的菌體彌補了這部分呼吸強度值，但是在檢測OD600nm值時并不能表現(xiàn)出來。8 h的活菌數(shù)明顯低10 h，可能原因是對數(shù)生長期的細胞容易形成細胞鏈[12]，普通搖勻振蕩很難有效分散成單個細胞，使得平板活菌計數(shù)中很多菌落由多細胞群體形成，從而導(dǎo)致測量的活菌數(shù)低于實際值。

（4）10～12 h為二次增長期，CER與OUR經(jīng)過短暫的急劇下降后出現(xiàn)了二次增長現(xiàn)象，與此同時，乙酸的積累量從急劇下降，pH值回升，說明乙酸作為碳源再次被消耗導(dǎo)致了二次增長現(xiàn)象。這階段雖然OD600nm值雖然有緩慢的增長趨勢，但是活菌數(shù)開始下降。同樣，此階段為產(chǎn)酶積累期，酶活在12 h達到最高，說明該酶的表達與菌體量的增長部分關(guān)聯(lián)，酶的大量積累需要一定數(shù)量的菌體累積作為前提。

（5）12 h后為衰亡期，由圖3可知，活菌數(shù)逐漸下降，進入衰亡期的菌體增多。在發(fā)酵結(jié)束時，雖然活菌數(shù)比對數(shù)初期（4 h）高，但呼吸強度卻遠低于對數(shù)初期，說明此時大部分菌體處于死亡或者瀕臨死亡狀態(tài)。在此階段酶活逐漸降低，到發(fā)酵20 h后酶活僅為17.78 U/mL。原因可能是，一方面質(zhì)粒穩(wěn)定性逐漸下降，說明在發(fā)酵后期，即使菌體仍然存在活性，但是質(zhì)粒逐漸丟失，因此產(chǎn)能降低；另一方面發(fā)酵營養(yǎng)條件的缺乏和有害代謝物的積累，可能激發(fā)細胞產(chǎn)生了比較劇烈的熱激反應(yīng)，由此產(chǎn)生的熱激蛋白會增強胞內(nèi)蛋白水解酶的活力[13]。

2.2 菌體生長與產(chǎn)酶的關(guān)聯(lián)性研究

重組大腸桿菌培養(yǎng)過程中通常采用增加“選擇壓力”來提高重組大腸桿菌質(zhì)粒的穩(wěn)定性。史悅等[14]發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒PETNHM在無抗生素選擇壓力下，連續(xù)傳代48代后質(zhì)粒開始丟失，進一步研究表明，卡拉霉素的選擇壓力下能夠保證質(zhì)粒的穩(wěn)定遺傳。發(fā)酵過程中質(zhì)粒的丟失可能會使重組大腸桿菌不再是優(yōu)勢菌，取而代之的是不帶質(zhì)粒的普通大腸桿菌。從前期實驗可知，在發(fā)酵過程中重組大腸桿菌的質(zhì)粒在4 h開始丟失，因此本實驗設(shè)計為對照組罐1：不流加氨芐；實驗組罐2當發(fā)酵4 h時，向發(fā)酵罐中流加氨芐溶液，并使發(fā)酵液中氨芐的終質(zhì)量濃度為100 mg/L。發(fā)酵過程中，定時取樣檢測比生長速率、OD600nm、活菌數(shù)、氨基酸態(tài)氮、乙酸、酶活以及質(zhì)粒穩(wěn)定性。實驗結(jié)果見圖5。

圖5 兩組實驗檢測比生長速率及OD600nm(A)、活菌數(shù)及質(zhì)粒穩(wěn)定性(B)、氨基酸態(tài)氮及乙酸含量(C)、酶活(D)結(jié)果對比Fig.5 Comparison results of specific growth rate and OD600nm(A),viable count and plasmid stablity (B),amino nitrogen and acetic acid contents (C) and enzyme activity (D) of the two experiments

由圖5A可知，從OD曲線看雖然實驗組的菌體最大累積量略大于對照組，但是除2～6 h時間段外大部分時間段內(nèi)實驗組比生長速率低于對照組；由圖5B可知，實驗組活細菌數(shù)到達最大值的時間為12 h，而對照組為10 h，雖然實驗組在10 h活菌數(shù)比對照組稍低，但在10～12 h后趕超。實驗組在發(fā)酵結(jié)束后仍有97%的菌體帶有質(zhì)粒；由圖5C可知，實驗組中氨基酸態(tài)氮的利用比對照組多，而在最大乙酸積累時期，實驗組積累的乙酸低于對照組；由圖5D可知，實驗組最大酶活（125.9 U/mL）高于對照組（92.2 U/mL），兩者出現(xiàn)的最高點均為12 h，從酶活曲線來看，酶活大量表達的時期為10～12 h。

結(jié)合上述現(xiàn)象可知，加入氨芐會使帶有質(zhì)粒的菌成為優(yōu)勢菌，這對于酮基還原酶的表達有一定的影響。首先，實驗組的比生長速率低于對照組，說明帶有質(zhì)粒的菌體傳代速率慢，而不帶質(zhì)粒的菌體傳代速率快，表明質(zhì)粒增加了菌體的代謝負荷。其次，在10～12 h內(nèi)實驗組活菌數(shù)高于對照組，相應(yīng)時間段發(fā)酵液中的代謝產(chǎn)物酮基還原酶的酶活也高于對照組，由此可說明外源蛋白的表達量依賴于帶有質(zhì)粒的活菌的數(shù)量，帶有質(zhì)粒的活菌數(shù)越高，酶活越高。另外，8～10 h，實驗組積累的乙酸以及比生長速率低于對照組，由于乙酸的積累不僅會限制菌體的生長[15]，而且會抑制產(chǎn)物的合成[16]，而減小對數(shù)生長期的比生長速率可以減少乙酸的積累[17]，帶有質(zhì)粒的菌體傳代速度較小，降低了比生長速率，同時也減少了乙酸的積累，進而使酮基還原酶的表達量增加。

與搖瓶實驗相比，在50 L發(fā)酵罐中，菌體最大累積量遠大于搖瓶，但酶活的表達量（無論有無添加氨芐）并沒有達到理想的水平?？赡苡捎趽u瓶發(fā)酵條件的控制與罐上發(fā)酵條件存在著巨大差異，使得放大過程中存在“放大效應(yīng)”[18]。此外，KR在大腸桿菌中的可溶性差[19]，發(fā)酵過程極易產(chǎn)生包涵體，包涵體形式的KR需要變性復(fù)性的過程才能顯示活性，因此也可能因為發(fā)酵罐中KR基因的表達過快而導(dǎo)致蛋白沒有正確的折疊而產(chǎn)生包涵體，使酶活低于搖瓶發(fā)酵的產(chǎn)量。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，重組大腸桿菌KR-C在50 L發(fā)酵罐中生長過程分為4個階段：延滯期（0～4 h），為菌體的適應(yīng)期；對數(shù)生長期（4～8 h），為菌體量積累期；穩(wěn)定期（8～10 h），為酶的表達前期，乙酸積累期，二次增長期（10～12 h），為酶大量積累期，乙酸消耗期；衰亡期（12 h 后），為菌體衰亡，酶被降解期。

另外，重組大腸桿菌KR-C發(fā)酵中的一些問題也值得關(guān)注：（1）碳源的缺乏是發(fā)酵中期導(dǎo)致菌體提前進入衰亡期的關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致酮基還原酶表達時間縮短的關(guān)鍵因素；（2）酮基還原酶的大量表達要以大量的活菌數(shù)和生長環(huán)境中較低的乙酸含量為基礎(chǔ)；（3）對數(shù)生長期的比生長速率對酮基還原酶表達有很大的影響，將比生長速率控制在0.3 h-1以下有利于酶活的提高；（4）在發(fā)酵后期，營養(yǎng)物缺乏可能導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白酶被激活，致使酶活迅速降低。

通過對重組大腸桿菌KR-C在50 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)酮基還原酶的特性研究，摸索了其發(fā)酵的基本規(guī)律，為以后進一步放大生產(chǎn)研究奠定了基礎(chǔ)，同時也為酮基還原酶的后續(xù)研究指明了方向。

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