食用菌發(fā)酵液對耐藥菌的抑菌活性研究

竇會娟，孫連海，郭文濤

（漯河醫(yī)學高等專科學校 基礎(chǔ)醫(yī)學部，河南 漯河 462002）

早在19 世紀70 年代，人們就發(fā)現(xiàn)多種擔子菌子實體、食用菌深層發(fā)酵液和固體培養(yǎng)物水浸液對植物病毒有抑制作用[1-2]。后又有多人研究結(jié)果表明，食用菌多糖具有抑菌作用[3-6]，本研究組也有研究表明，香菇的液體發(fā)酵產(chǎn)物對機體致病菌也有一定的抑菌作用[7]。近幾年，由于抗生素的廣泛使用，臨床上出現(xiàn)的耐藥菌日漸增多，給治療帶來麻煩。我國藥食用真菌資源豐富，無毒副作用，而且大型藥食用真菌可以較方便地通過菌絲體或孢子發(fā)酵培養(yǎng)[8]，但其發(fā)酵液對耐藥菌的抑菌情況的研究較少。

本研究選用香菇（Lentinula edodes）、雞腿菇（Coprinus comaus）、金針菇（Flammulina velutipes）、茶樹菇（Agrocybe aegerita）、杏鮑菇（Pleurotus eryngi）、木耳（Auricularia auricula）、猴頭菇（Hericium erinaceus）7種較常見的食用菌菌種，采用液體深層發(fā)酵的方法獲得其發(fā)酵液，以兒科臨床分離得到的3種耐藥菌較強的肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）為指示菌，用管碟法測定發(fā)酵液對細菌的抑菌圈，通過抑菌率反映其對耐藥菌的抑菌效果，為更好地開發(fā)食用菌相關(guān)產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 食用菌與指示菌

供試食用菌分別是香菇、雞腿菇、金針菇、茶樹菇、杏鮑菇、木耳、猴頭菇：本實驗室保存菌種；供試耐藥菌分別為肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸埃希菌（Escherichia coli）：漯河市某醫(yī)院兒科臨床分離標本并保存；肺炎鏈球菌ATCC 49619、金黃色葡萄球菌ATCC 2592、大腸埃希菌ATCC25922標準菌株：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[9]：馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.5g，硫酸鎂MgSO4·7H2O0.25g，瓊脂20g，加水至1 000 mL。

一級搖瓶液體培養(yǎng)基[10]：蔗糖30 g，蛋白胨3 g，酵母2 g，硫酸胺2 g，磷酸二氫鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖30 g，玉米粉20 g，麩皮40 g，加水至1 000 mL，調(diào)pH值至7.0。

1.1.3 化學試劑

磷酸二氫鉀（KH2PO4）：天津市風船化學試劑科技有限公司；硫酸銨：鄭州辰尼化學試劑廠；七水硫酸鎂（MgSO4·7H2O）、葡萄糖：天津市科密歐科技有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHZ-CA 大容量恒溫振蕩器：江蘇太倉市實驗設(shè)備廠；LRH-250-HS恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 食用菌菌種的活化

取出保存菌種，用接種環(huán)取出一小塊，在含有玻璃珠的無菌水中振蕩，用無菌吸管吸取0.2 mL涂平板，28 ℃培養(yǎng)6 d，挑取單菌落移接到斜面PDA培養(yǎng)基上，加上棉塞，置恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)6 d后可見組織塊上長出絨毛狀菌絲，菌絲長滿斜面即得斜面菌種。

1.3.2 液體種子制備

用300 mL三角瓶裝液體種子培養(yǎng)基100 mL，接入活化的斜面菌種（0.4 cm2大小5塊）。放入28 ℃、180 r/min下的搖床培養(yǎng)5 d，即得液體搖瓶種子。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

參照香菇液體發(fā)酵產(chǎn)抑菌物質(zhì)活性最高的發(fā)酵條件[11]，發(fā)酵液初始pH 值為5，300 mL三角瓶裝液體發(fā)酵培養(yǎng)100 mL，接入7%的液體菌種，于28 ℃、180 r/min的搖床中培養(yǎng)8 d。

1.3.4 細菌菌懸液制備

將細菌菌株接種于PDA斜面，37 ℃培養(yǎng)48 h，用生理鹽水配成106～107CFU/mL的菌懸液備用。

1.3.5 管碟法[12]測定抑菌活性

采用密集劃線法將細菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)皿中間放置1個滅菌牛津杯（高10 mm、內(nèi)徑6 mm），每個牛津杯中加入200 μL液體發(fā)酵液，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，48 h后測量抑菌圈直徑，細菌的標準菌株和相應(yīng)的臨床分離菌株同時進行，每個處理重復(fù)3次，計算菌落直徑和相對抑菌率[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌的抑制

采用管碟法測定食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌標準菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計算相對抑菌率，結(jié)果見表1。

表1 食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌的抑菌情況Table 1 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Streptococcus pneumoniae

由表1可知，各食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌的抑菌活性是較低的，雞腿菇發(fā)酵液的抑菌圈直徑4.433 mm為最大值，杏鮑菇發(fā)酵液的抑菌圈直徑1.033 mm，為最小值。且各食用菌發(fā)酵液對分離到的肺炎鏈球菌的相對抑菌率也都較低，雞腿菇發(fā)酵液的相對抑菌率30.370%為最大值，金針菇和杏鮑菇發(fā)酵液的相對抑菌率最低，均在10%以下。結(jié)果表明，食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌的抑菌效果較差。

2.2 食用菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑制

采用管碟法測定食用菌對金黃色葡萄球菌標準菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計算相對抑菌率，結(jié)果見表2。

表2 食用菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌情況Table 2 The inhibition effect of mushroom fermentation broth to Staphyloccocus aureus

由表2可知，金針菇發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑最大，達到6.733 mm，香菇發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑次之，為5.068 mm。香菇的相對抑菌率最高，為62.017%；金針菇次之，58.686%。相對于肺炎鏈球菌及大腸桿菌來說，7種食用菌發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑和相對抑菌率均較高，有較好的抑菌活性。

2.3 食用菌發(fā)酵液對大腸桿菌的抑制

采用管碟法測定食用菌對金黃色葡萄球菌標準菌株和臨床分離菌株的抑菌圈，并計算相對抑菌率，結(jié)果見表3。

表3 食用菌液體發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌情況Table 3 The inhibition effect of mushroom submerged fermentation broth to Escherichia coli

由表3可知，金針菇發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌圈直徑最高，達到了5.267 mm，但其相對抑菌率很低（＜10%）；其他食用菌發(fā)酵液對大腸桿菌的相對抑菌率均＜30%。結(jié)果表明，食用菌發(fā)酵液對肺炎鏈球菌的抑菌效果較差。

3 結(jié)論

從實驗結(jié)果來看，同一種食用菌對不同病原菌的抑菌作用差別較大，可能是不同細菌的致病機制不同而引起的，也可能是由于不同細菌的耐藥機制不同而引起的。

本實驗中的相對抑菌率實質(zhì)上體現(xiàn)的是食用菌發(fā)酵液對標準菌株和臨床分離菌株的抑菌情況的比率，相對抑菌率高就代表該食用菌對耐藥菌的抑菌效果好。李孫洋等[14]研究結(jié)果表明，相對抑菌率在50%以上有開發(fā)利用價值。本實驗選用的臨床分離菌株金黃色葡萄球菌中，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）檢出率為53.8%，而且該菌株對青霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、四環(huán)素、阿奇霉素、克林霉素的耐藥性均較高，MRSA的耐藥率明顯高于對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（methicillin susceptibleStaphylococcus aureus，MSSA）[15]，所以對于臨床分離到的耐藥性較強的金黃色葡萄球菌，下一步可以考慮開發(fā)食用菌的液體發(fā)酵產(chǎn)物來控制其感染。但對于大腸桿菌和肺炎鏈球菌來說，由于各食用菌發(fā)酵液對其抑菌圈和相對抑菌都較低，想要考慮利用食用菌發(fā)酵產(chǎn)物來進行抑菌意義就不大了。

本研究所選用的食用菌品種均比較常見，其液體發(fā)酵方法也比較成熟，但其對臨床耐藥菌的抑菌研究還鮮有報道。由于發(fā)酵液只進行了初步純化，下一步有必要對發(fā)酵液的活性物質(zhì)和發(fā)酵條件進行進一步深入研究。

[1]高現(xiàn)亮，羅華元.多種食用菌粗提液對煙草病原菌的抑制效果[J].中國食用菌，2014，33（3）：34-37.

[2]孟俊龍，馮翠萍.香菇多糖抑菌作用的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學學報：自然科學版，2012，32（3）：261-264.

[3]耀 坤，陳旭健.鐵椆與紅菇提取液抑菌作用的比較[J].食品科學，2011，32（5）：36-38.

[4]任慧波，杜麗飛.松乳菇菌絲體胞內(nèi)多糖與胞外多糖體外抑菌試驗[J].飼料工業(yè)，2009，30（20）：31-32.

[5]趙成萍，馮翠萍.靈芝多糖抑菌作用的研究[J].中國食用菌，2012（2）：60-64.

[6]辛英姬，方紹海，王筱凡，等.茶樹菇多糖抑菌效果的試驗[J].中國食用菌，2011（4）：64-65.

[7]竇會娟，張群芝.液體深層發(fā)酵香菇抑菌活性研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2010，38（6）：2919-2920.

[8]潘春磊，盛春鴿.食用菌保健功能及產(chǎn)品開發(fā)技術(shù)研究進展[J].北方園藝，2014，15（8）：197-200.

[9]李阜棣.農(nóng)業(yè)微生物學實驗技術(shù)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[10]金 紅，楊孝麗.食用菌深層發(fā)酵物中生物活性物質(zhì)含量的比較[J].食品研究與開發(fā)，2015，36（2）：93-96.

[11]竇會娟，張群芝.香菇產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)液態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國釀造，2014，33（9）：45-48.

[12]李 昕，趙 月.32 味中藥水提物對4 種真菌抑菌實驗研究[J].遼寧中醫(yī)藥大學學報，2015，17（3）：36-39.

[13]王 淵，張 芳.6 種殺菌劑對4 種常見植物病原菌的抑制作用[J].干旱區(qū)資源與環(huán)境，2013，27（11）：92-95.

[14]李孫洋，邱其偉.12 種藥用植物粗提物對4 種植物病原真菌抑菌活性研究[J].中國植保導(dǎo)刊，2014，34（1）：5-9.

[15]竇會娟，曹興華.漯河市某醫(yī)院兒童感染性疾病病原菌及耐藥性調(diào)查[J].中國消毒學雜志，2013，30（10）：951-953.